生体画像処理プラットフォームとしての薄膜ノッチフィルター

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4494 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

多くの画像処理操作には、画像の空間周波数内容の変更が含まれます。ここでは、市販のスペクトル帯域消去フィルタの角度感度を利用した物体面空間周波数フィルタリングを実証します。全光学画像処理へのこのアプローチは、ヒト子宮頸がん細胞などの透明な生体サンプルやその他のサンプルのリアルタイム疑似 3D 画像を生成することが示されています。この研究は、ラベルフリーの生物学的細胞イメージングおよび動的モニタリングにおける使用のための画像処理に対する非局所的、非干渉的アプローチの可能性を実証しています。

ほとんどの生体細胞を含む透明な物体は光と弱く相互作用するため、従来の明視野顕微鏡ではコントラストがほとんど得られません。ただし、それらの形態および光学特性の空間的変化により、それらを透過する光に局所的な位相変化が生じます。最も単純なケースでは、これは伝達関数 \(O(x,y) \about O_0 e^{i\varphi (x,y)}\) によって特徴付けることができます。ほぼ空間的に不変の振幅 \(O_0\) は、特徴のない強度画像 \(|O(x, y)|^2 = |O_0|^2\) を生成しますが、形状と屈折率の情報は位相関数 \ に含まれています。 (\varphi (x,y)\)。このような位相変化は従来のカメラでは直接検知できないため、間接的な検出が必要です。一般的な光学位相視覚化方法には、シュリーレンイメージング 1、ゼルニケ位相コントラスト 2、暗視野 3、微分干渉コントラスト顕微鏡 4 などがあります。ただし、これらには高価なコンポーネントやフーリエ面へのアクセスが必要になる可能性があり、システムの複雑さとサイズが増大します。デジタル手法には、タイコグラフィー 5、6、7、強度伝達方程式 8、9、10 の使用、または Gerchberg-Saxton 11 や Fienup アルゴリズム 12 などの位相検索アルゴリズムが含まれます。ただし、これらは広範な計算要件によって制限される可能性があります。

全光学式の物体面画像処理は、位相可視化のための非干渉式でコンパクトな代替手段を提供します。これは、波面の空間周波数を直接フィルタリングする角度応答性を備えた薄膜 13、14 などの 2D 空間不変線形光学システムによって可能になります 15。古典的な \(4f\) 構成 16 を利用した一般的な計算手法や全光学的手法とは異なり、光位相情報の損失、エネルギーを消費する後処理、フーリエ面へのアクセスに伴うかさばる構成を回避します。全光学式の物体面画像処理におけるコンパクトな光学システムの重要性は、携帯機器への統合の可能性によって動機付けられています。これは、モバイル診断、環境モニタリング、リモートセンシングなど、さまざまな用途に使用できます。

角度分散を示すデバイスがどのように画像処理を実行できるかを説明するために、簡単にするために偏光効果を無視します。この場合、物体面のフーリエフィルター処理が場の空間周波数スペクトルに及ぼす影響は、光学伝達関数 \({\mathscr {H}}(k_x, k_y)\) によって説明できます17。 \(z\) 軸を光軸として、\(k_{x}\) と \(k_{y}\) は波動ベクトル \(\vec {k} の横空間周波数成分を表します) = (k_x, k_y, k_z)\) および \(k_z = \sqrt{|\vec {k}|^2 - k_x^2 - k_y^2}\)。伝達関数は、畳み込み定理によって処理された出力を入力フィールドに関連付けます。

ここで、 \({\mathscr {F}}\) はフーリエ変換を表し、 \(E\) は電場の任意の成分を表し、 \(\tilde{E}_{\text {in}} = {\mathscr { F}}\left\{ E_{ \text {in} } \right\}\)。たとえば、ハイパスフィルターは低空間周波数をブロックして、データ圧縮 19 やマシンビジョン 20、21 の基礎となるエッジ検出 18 の非散乱フィールド成分を除去します。注目すべきサブクラスは、空間導関数を計算できる線形光学伝達関数、つまり \({\mathscr {H}} \propto k_x\) または \({\mathscr {H}} \propto k_y\) のサブクラスです。、それぞれ \(x\) または \(y\) 方向に沿った入射波動場の乗法定数まで。その結果、位相勾配を強度変化にマッピングして、透明なサンプルの場合の位相の視覚化を可能にすることができます13。 \(2 \times 2\) 伝達関数の二項テンソルを利用することで、偏光の影響をこのアプローチに組み込むことができます。

角度感度は、入射角と空間周波数の対応を通じて画像処理のメカニズムを提供します。これは、空間周波数成分を球面座標で表すことによって与えられます15。

ここで、 \(k_0=|\vec {k}|\) は波数、 \((\theta , \phi )\) は \(z\)- に対する平面波の極伝播角度と方位伝播角度です。軸。光学伝達関数が \(k\) 空間の平面波応答を表し、光が空間フーリエ変換によって重み付き平面波に分解できることを考えると 15,22、角度分散透過を示すデバイスは物体面での透過が可能であるということになります。画像処理。

近年、超小型画像処理装置としてメタオプティカルデバイスが注目を集めている23。たとえば、Zhou ら 24 は有機サンプルのエッジ検出にフォトニック結晶を使用し、一方 Wesemann ら 25 は共振導波路回折格子を使用してヒトの癌細胞の位相コントラスト画像を取得しました。他のアプローチには、Mie26、27 または Fano28 共鳴、フォトニックスピン軌道結合効果 29、30、および連続体における束縛状態 31 が含まれています。メタオプティクスへの関心が急速に高まっているため、同等の役割を果たすことができる他の光学要素を検討するのは時宜にかなったことです。これまでの研究では、体積ホログラムフィルター 32、ファブリペローエタロン 33、離調干渉フィルター 34、35、音響光学変調器 36、回折格子 37、38、39 など、エッジ検出のためのさまざまな構造が研究されてきました。フーリエ平面位相コントラスト法を除いて、画像処理に成功したデジタル方式の出現により、全光学技術のさらなる進歩が妨げられました。ただし、生成されるデータの急速な増加と、それに伴うエネルギー消費と処理速度への影響を考慮して、この点が再検討されています。

ここでは、市販の薄膜スペクトルノッチフィルターを透明サンプルの位相コントラストイメージングに適用して使用する方法を示します。ノッチフィルターは、特定の範囲にわたる時間周波数を除去するためにさまざまな種類の分光法で一般的に使用される帯域阻止フィルターです 40,41。フィルターの阻止帯域の角分散により、動作波長でハイパス空間周波数フィルターが生成されることが示されています。ここで紹介するアプローチは、光軸に対してフィルターを傾けることによって位相バイアスを導入し、微分干渉コントラスト顕微鏡で得られるものと同様の擬似三次元画像を生成することに基づいています。発生するコントラストは回転軸と角度によって決まり、画像の視野と解像度は光学系の仕様によって決まります。空間光変調器と未染色の生体サンプルによって導入された波面の強化されたコントラストイメージングを実証します。私たちの結果は、後処理なしで瞬間的な位相コントラストイメージングを確認し、カメラまたは目のいずれかを使用して直接イメージングを可能にします。この方法は、既製のスペクトル帯域阻止フィルタを使用すること以外は、従来の方法と同等の画像処理能力を備えた、生物学的およびその他の画像処理のための代替の全光学的アプローチを提供します。提案されたアプローチの可用性とシンプルさにより、このアプローチは、あらゆるイメージングシステム内の位相コントラスト画像についての洞察を得るのに高速で有用な技術となっています。したがって、マシンビジョン、生物学的イメージング、および動的モニタリングの発展の可能性を秘めています。

ここで調査したデバイスは市販のノッチフィルタ (Thorlabs NF633-25) で、垂直入射での指定中心動作波長 633 nm と帯域幅 25 nm を備えています。入射角の関数としてのデバイスの透過スペクトルは、図 1 の構成を使用して実験的に測定されました。詳細は「方法」セクションに記載されています。ハロゲンランプからの平行白色光は、さまざまな入射角でノッチフィルターを通過し、分光計に焦点を合わせました。円偏光を使用して得られた結果 (図 2a) は、メーカーの仕様と一致しています。一方、\(p\) 偏光と \(s\) 偏光の結果は補足情報 (§S1.1) に示されています。これらの結果は、帯域幅約 25 nm の動作波長での帯域阻止と、入射角の増加に伴うバンドストップ領域のブルーシフトを確認します。入射角と空間周波数の対応に注目すると、ノッチフィルターがバンドストップ波長で垂直に近い入射角に関連する低い空間周波数を抑制することがわかります。

ノッチフィルターの透過スペクトルをキャプチャするために使用された実験構成。ここで、LP と QWP はそれぞれ直線偏光子と 1/4 波長板を示します。回路図は縮尺通りではありません。

\(p\)-、\(s\)-、および円偏光の変調伝達関数 \(\vert{\mathscr {H}}(k_x, k_y)\vert\) は、測定された透過スペクトルから図にマッピングされました。 .2a. バンドストップ波長における \(k_y=0\) (図 2b) に沿ったラインプロファイルは、開口数 (NA) 範囲 \(0.20\) の抑制ゾーンを持つ、ほぼ偏光に依存しないハイパス動作を示します。これは、入射角の増加に伴うバンドストップ波長のブルーシフトの結果です。このデバイスの重要な特徴は、抑制ゾーンを超えたゼロからほぼ 1 までの透過率が \(k_x\) にほぼ線形に依存する領域です。これは、関係 \(A k_x/k_0 + B\ で表される \(k_x/k_0 \約 0.20\) から \(0.30\) までの円偏光の変調伝達関数の線形フィッティング (図 2c) によって裏付けられます。）。 MATLAB の Polyfit 関数とカーブフィッティングツールボックスを使用して、フィッティングパラメーターとその誤差区間を \(A = 5.9 \pm 0.83\) および \(B = -0.97 \pm 0.22\) として取得しました。光軸に垂直な線を中心にフィルターを \({12}^\circ\) 回転させると、動作が \(k_x/k_0 \about \pm 0.20\) にシフトし、ここではコントラストゾーンと呼ばれるこの領域にアクセスします。このデバイスの機能により、波場の位相変化を強度変化の形で視覚化できます。

フィルターを段階的に回転させることによって得られたフィルターの実験的な送信応答 (a)。 (a) の破線は 633 nm のバンドストップ波長を示し、矢印は垂直入射におけるバンドストップ領域の幅を示します。さまざまな偏波に対する \(k_y=0\) に沿った変調伝達関数の係数二乗 (b) が、メーカーから提供されたデータと比較されます。コントラストゾーンにおける円偏光の変調伝達関数の線形フィッティングを(c)に示します。

ノッチフィルターが波面の位相勾配に関連するコントラストをどのように生成するかを説明するために、波長 \(\lambda\) と波数ベクトル \(\vec の垂直入射の単色平面波 \(E_s(x,y,z)\) を考えてみましょう。 {k}\) は Z 軸に沿って伝播します。光源は、透過関数 \(O(x, y) = O_0 e^{i \varphi (x, y)}\) を使用して透明なサンプルを照明します。その視覚化には、それを透過する光に与えられる位相シフトを強調表示する必要があります。これは次のようにモデル化できます。

ここでは簡単にするためにベクトル効果を無視しています。導関数のフーリエ変換に次の特性があるとすると、

次に、線形光学伝達関数と式(1)を計算します。 (3) を式に代入します。 (1) \(O(x,y)\) の空間導関数を生成します。

これにより、 \(| \partial \varphi (x,y)/\partial x |^2\) または \(| \partial \varphi (x,y)/\partial y |^2\) に比例した強度画像が生成されます。位相が微分方向に沿って変化する領域にコントラストが作成されます。

ノッチフィルターは、コントラストゾーン内の角度オフセットの周りの空間導関数を近似的に生成します。補足情報 (§ S1.2)。したがって、生成される画像は、シュリーレンイメージングや暗視野顕微鏡で得られる画像と同等になります。正規化された空間周波数 \(k_x/k_0 \約 0.24\) に対応する回転角 \({14}^\circ\) でコントラストゾーン内に操作をシフトすると、背景フィールドの一部が保存され、次のような区別が可能になります。正および負の位相勾配。これらは、それぞれ、シフトされた \(k\) 空間原点の上または下の異なるグレースケールレベルとして現れます。したがって、コントラストゾーン内で動作すると、位相の変化を強度の変化にマッピングすることにより、位相の視覚化が可能になります。いくつかの非散乱成分の存在は、これを暗視野イメージングと区別するゼロ以外の強度のバックグラウンドを保持します。代わりに、勾配の符号に関する情報を介して、微分干渉コントラスト顕微鏡で見られるものと同様の疑似三次元コントラストを作成します。さらに、回転軸を変更することでコントラストの種類を制御し、さまざまな方向に沿った位相勾配を視覚化できます。これらは、位相視覚化のためのノッチフィルターの能力を説明するこの記事の重要な基礎を形成します。

円偏光の 635 nm レーザー光を使用し、ノッチフィルターを使用してさまざまなサンプルに対して全光学画像処理を実験的に実行しました。振幅サンプルのエッジ検出は、USAF 解像度テストターゲットで最初に実証され、詳細と結果は補足情報 (§S1.2) で提供されています。次に、図 3 の構成を使用して位相コントラストイメージングを実行しました。これについては「方法」セクションで詳しく説明します。 \({8}\,\upmu \hbox {m}\) ピッチの 1920 \(\times\) 1080 個の液晶ピクセルで構成されるコンピュータ制御の空間光変調器は、人間の赤血球の位相プロファイルをエミュレートしました (図 1)。 4a)。これらは、Ref.42 で提供されている光学特性を使用してモデル化されました。空間光変調器から反射された平行光はノッチフィルター上に結像され、デバイスのコントラストゾーン内で確実に動作するように対物レンズ間の焦点面内で回転させられました。次に、送信された画像がカメラで撮影されました。システムの視野は、空間光変調器と光学コンポーネントの開口によって設定されました。

空間光変調器 (SLM) を使用した画像処理の実験構成。L と MO はそれぞれレンズと顕微鏡の対物レンズを示します。回路図は縮尺通りではありません。

結果は図 4b ～ e に示されており、シミュレーション画像と実験画像が比較されています。実験的な対照画像（図4b）はコントラストが低く、吸収の弱いサンプルで予想されるように、物体は事実上見えなくなります。これは、図3の構成を使用してノッチフィルターがない状態で画像をキャプチャすることによって取得されました。シミュレートされた位相画像（図4c）は、Pythonで実行された数値シミュレーションを使用して取得されました。これについては「方法」セクションで詳しく説明します。対応する実験的位相画像（図4d）は、図3の構成で回転したノッチフィルターを使用して取得しました。シミュレーションと実験の両方のケースで、ノッチフィルターは \({14}^\circ の角度で回転しました） \) コントラストゾーンにアクセスします。これらは、非ゼロ強度のバックグラウンドから明らかな、いくつかの散乱されていない寄与を保存しました。どちらの場合も、位相の変化が存在する領域、つまり \(\nabla \varphi (x,y) \ne 0\) は、目に見えない位相変調によって生じる強度コントラストで明らかになります。

画像処理は、位相偏位 \(6\pi /5\) の空間光変調器によってエミュレートされた透明な赤血球 (a) に対して実行されました。ノッチフィルターがない場合に得られた実験的な制御画像を (b) に示します。一方、ノッチフィルターによって生成されたシミュレーション (c) および実験 (d) の位相画像は、位相の視覚化を示しています。強度画像 (b) ～ (d) は最も明るいピクセルに正規化されていますが、(a)、(c)、(d) に示す破線に沿ったラインプロファイルは (e) に示されています。

図4a〜dの画像上のスケールバーで示されているマイクロメートルの解像度は、光学システムによって決定されました。得られた位相画像はさらに、正と負の位相勾配を区別する能力を備えており、擬似三次元位相コントラストの出現につながりました。さらに、ラインプロファイル（図4e）は、サンプルによってフィールドに導入された位相変化に関連する強度変化を示します。場の振幅変動から生じる強度アーチファクトや、サンプルを取り囲むギブス現象に関連するリンギングアーチファクトなど、いくつかの強度アーチファクトも見られます。

潜在的な用途を説明するために、振幅コントラストが弱い生体サンプルに対して位相差顕微鏡検査を実行しました。これは、図5aに示し、「方法」セクションで概要を説明した倒立顕微鏡構成を使用して達成されました。ヒト子宮頸がん由来の細胞株 (HeLa) をサンプルとして使用し、「方法」セクションで概要を説明した調製手順を実行しました。ノッチフィルターの非存在下で得られた明視野画像（図5b）は、コントラストが低く、細胞の特徴の詳細がほとんどまたはまったく表示されません。しかし、サンプルの直下にノッチフィルターを配置すると、入射角 \({14}^\circ\) で 635 nm のレーザー光を照射したときの位相変化を視覚化することができました。コントラストゾーン内で得られた位相コントラスト画像（図5c）には、破線の円内で強調表示されているものなど、対応する明視野画像には存在しない形態学的詳細が含まれています。生成される位相コントラストは、比較的低コントラストの明視野画像と比較して大幅に強化されます。細胞の厚さと局所的な屈折率の偏差が強調され、細胞を背景から区別します。

生物学的位相イメージングは、(a) の実験概略図を使用して実行されました。破線はペトリ皿内の HeLa 細胞を表しており、概略図は縮尺通りではありません。ノッチフィルターを使用せずに得られたHeLa細胞の明視野画像を(b)に示します。フィルターを使用して得られた対応する位相コントラスト画像を (c) に、微分干渉コントラスト画像を (d) に示します。 (b) ～ (d) に示す破線の円は、比較の目的でコントラストが大幅に強化された領域を強調表示しています。

比較のベースラインとして、「方法」セクションで概説した構成を使用して、細胞の同じ領域の従来の微分干渉コントラスト画像が取得されました。得られた画像 (図 5d) も、明視野画像 (図 5a) に対して顕著な位相コントラストを示します。画像の品質は、ノッチフィルターで得られた関連画像と同様であることが示されています (図 5b)。さらに、両方の画像は顕微鏡構成で撮影されており、その解像度はその基礎となる光学コンポーネントによって決定されます。画像のスケールバーで示されているように、マイクロメートルの解像度が得られました。その結果、マイクロメートルオーダーの特徴がシステムによって分解され、ノッチフィルターによって明らかになりました。

メタオプティカルイメージングに対する最近の関心の高まりに触発されたこれらの結果は、市販のノッチフィルターを使用した生物学的画像処理の最初の実証を表しています。画像の空間周波数内容は、フーリエ平面にアクセスする必要なく、物体平面内のデバイスによって直接変更されました。伝達関数は、空間微分による位相の視覚化を可能にするほぼ線形領域に加えて、エッジ検出を可能にするハイパスフィルタリングに必要な動作を示しました。フィルターを回転すると、\(k\) 空間でフーリエ原点をオフセットするこれらの領域にアクセスできるようになりました。

画像で得られたコントラストは、ノッチフィルターを使用しない場合の関連画像と比較して大幅に向上しました。位相変化の領域は、フィルタリングされた画像内の強度変調に対応しました。画像の品質は、微分干渉コントラスト顕微鏡で得られたものと同等でした。後者は干渉効果を利用して、ウォラストンプリズムの方向に沿って画像内に疑似 3 次元コントラストを生成します。一方、ノッチフィルターは、比較的高価でかさばるコンポーネントを使用せずに、回転方向によって決まる同等のコントラストを生成しました。ゼルニケ位相差顕微鏡法も同様に、空間周波数フィルタリングを通じて波動場の位相を視覚化します。しかし、このフーリエ平面法では、ノッチフィルターとは異なり、波面の位相勾配の正負を区別することができません。さらに、位相勾配が強すぎる場合にも画像にアーティファクトが生成されます。ノッチフィルターの場合、位相勾配が強すぎると、位相勾配がコントラストゾーンから外れてしまい、画像に表示されなくなります。ただし、フィルターの厚さが原因でアーチファクトが発生する可能性があります。

補足情報 (§S1.2) では、ノッチフィルターがコントラストゾーンの端付近を操作することにより、シュリーレンイメージングで得られるものと同様の画像を生成できることが示されました。シュリーレン法では、画像の正または負の空間周波数をブロックします。同様に、ノッチフィルターは、コントラストゾーンの端近くのシフトされた \(k\) 空間原点より下の空間周波数を抑制しますが、それより上の空間周波数は透過するため、シュリーレン法にほぼ対応します。さらに、抑制ゾーン内で動作すると、暗視野顕微鏡の場合のように低い空間周波数が除外されることに関連して、ノッチフィルターを透過する光が強力に抑制されることになります。これにより、暗い背景上でエッジなどの強い位相変化の特徴を強調する、透明なサンプルの暗視野画像が生成されます。その結果、市販のノッチフィルターは、追加の高価な機器を使用せずに、画像処理による非干渉位相視覚化のための、比較的コスト効率が高く、容易に入手できる代替手段を提供します。これらは、他の位相視覚化方法と比較して優れたコントラストと品質の画像を生成することができ、これらが利用できない場合や高価すぎる場合に特に役立ちます。フィルターを使用して得られる画像の解像度と視野は、使用される光学系によってのみ制限されます。

帯域阻止領域は可視帯域内に限定されていましたが、電磁スペクトル全体をカバーするようにさまざまなフィルターが設計されています。例えば、Yuan et al.43 は、アセチレンガスの吸収帯域で使用可能なフォトニックフィルターを発表しました。その他には、テラヘルツ 44、赤外線 45、マイクロ波 46、47、市販の紫外線フィルターなどがあります。これらは、この論文で概説した方法を使用したスペクトル全体の位相イメージングの可能性を秘めており、可視範囲を超えたマシンビジョンや生物学的イメージングに応用できます。既存のイメージングセンサーを使用して、位相変化を通じて試料の構造ダイナミクスを動的に明らかにするノッチフィルターを使用して、ライブ生物学モニタリングが可能です。さらなる用途には、環境モニタリングや、位相感知検出器を形成するための従来のポータブルセンサーへの統合が含まれます。ノッチフィルターを検出面に組み込むと、無差別な強度ベースのデバイスに空間周波数の選択性と位相の変化が導入されます。

位相コントラストはノッチフィルターによって生成されましたが、コントラストゾーンでのその動作は完全に線形ではありませんでした。さらに、開口数が制限されているため、適用できるサンプルの範囲が制限されます。また、抑制ゾーンの角度範囲が広いため、コントラストが十分に鮮明な特徴に制限されます。サンプルの範囲が制限されるだけでなく、ノッチフィルターを回転する必要があります。最後に、ここで示した理論的および数値モデリングには、ビーム経路に摂動を導入する可能性がある無視できないノッチフィルターの厚さが含まれていませんでした。これにより、補足情報 (§S1.2) のエッジ強調画像のような収差が発生する可能性があります。ただし、ここで実行された実験の成功により、ノッチフィルターが既存の位相コントラストイメージング法の代替として使用できるという確信が得られます。さらに、収差を最小限に抑え、伝達関数を調整するために、厚さを薄くしたカスタム薄膜デバイスを開発することもできます。

結論として、この記事では、市販のスペクトルノッチフィルターを使用した、リアルタイムの全光学式の物体面画像処理を実証しました。分光測定により、ハイパス空間周波数フィルタリングと位相コントラストイメージングに必要な角度分散帯域阻止が検証されました。エッジ検出は、散乱されていないフィールド成分が除去される抑制ゾーンを通じて実現できました。一方、伝達関数をコントラストゾーン内のほぼ線形領域にオフセットすると、微分干渉コントラスト顕微鏡で得られるものと同等の位相コントラスト画像が生成されました。ヒト子宮頸がん由来の細胞株を含む、他の方法では目に見えない位相変調を課す未染色の生体サンプルが、フィルターによって視覚化されました。したがって、ノッチフィルターは、他の位相イメージング方法と同等の役割を果たすことができる、瞬間位相視覚化に代わる非干渉式の既製の代替手段を提供します。これは、医療診断、非侵襲的な微生物の増殖、動的モニタリングなど、ラベルフリーの生物医学イメージング48に重要な意味を持ちます。その結果、可視帯域を超えて拡張し、商業化に向けたモノリシック空間周波数感知カメラを構築するという開発の可能性が開かれました。

数値シミュレーションは、Python 3.9.549 で式を実装することによって実行されました。 (1) ノッチフィルターの伝達関数を使用します。実験的に測定された変調伝達関数は、ノッチフィルターの光学応答をモデル化するためにメーカーから提供された補間位相応答と組み合わされました。この記事で使用したノッチフィルタ(Thorlabs NF633-25)は厚さ3.5 mmで、五酸化タンタル(Ta\(_2\)O\(_5\))と二酸化ケイ素(SiO\(_2\))の薄膜で構成されています。溶融石英基板。

ファイバー結合 (Thorlabs SM600) ハロゲンランプ (Ocean Insight HL-2000-FHSA) からの白色光を、顕微鏡対物レンズ (Nikon U Plan FL 20x/0.15NA) を使用してコリメートしました。この光は直線偏光子 (Thorlabs LPVIS050-MP) によって偏光され、\(p\) 偏光または \(s\) 偏光が生成されます。円偏光は、ノッチフィルターを照射する前に追加の 1/4 波長板 (Thorlabs AQWP05M-600) を導入することによって生成されました。レンズ (Thorlabs LA1068-A、\(f={75}\,\hbox {mm}\)) は、透過光をファイバー結合 (Thorlabs M15L01) 分光計 (Ocean Insight QE6500) 上に集光しました。透過スペクトルの測定は、フィルターを \({2}^\circ\) ずつ段階的に回転させることにより、\({-30}^\circ\) から \({+30}^\circ\) の範囲の入射角に対して行われました。 \)。

ファイバー結合 (Thorlabs SM600) 635 nm レーザー光 (Thorlabs S1FC635) は、顕微鏡対物レンズ (Nikon LU Plan 5x/0.15NA) と 2 つのレンズ (Thorlabs LA1027-A \(f={75}\,\hbox { mm}\) および LA1509-A \(f={100}\,\hbox {mm}\))。直線偏光子 (Thorlabs LPVIS050-MP) により、直線偏光が反射型空間光変調器 (Holoeye Pluto-2.1-VIS-001 LCOS-SLM) を確実に照射します。これは、ヒト赤血球の位相プロファイルを \(6\pi /5\) の位相偏位でプログラムしました。 SLMから反射された光は、1/4波長板(Thorlabs AQWP05M-600)を通過して円偏光に変換されます。レンズ (Thorlabs LA1433-A \(f={150}\,\hbox {mm}\)) と顕微鏡対物レンズ (Olympus Plan N 20x/0.4NA) により、焦点面のノッチフィルター上に画像が縮小されます。後者は、コントラストゾーンにアクセスするために回転マウントを使用して \({14}^\circ\) だけ縦方向に回転しました。顕微鏡対物レンズ（Olympus Plan N 20x/0.4NA）とレンズ（Thorlabs LA1131-A \(f={50}\,\hbox {mm}\)）を使用してフィルタリングされた画像を再拡大し、カメラ（Thorlabs DCC1645C）に焦点を合わせました。）。

明視野顕微鏡検査は、ノッチフィルターなしの倒立顕微鏡 (Nikon Ti-80i) からの白色光を使用して実行されました。次に、照明光源を、対物レンズ (Olympus A4 4x/0.1NA)、直線偏光子 (Thorlabs LPVISC100-MP2) および 1/4 波長板 (Thorlabs) でコリメートされたファイバー結合 (Thorlabs SM600) 635 nm レーザー光 (Thorlabs S1FC635) に置き換えました。 AQWP05M-600）は円偏光を発生させました。これらの光学コンポーネントは、入射角を変えるために XYZ ステージに取り付けられた光学ケージ内に含まれていました。ノッチフィルターを顕微鏡ステージ上のサンプルの直下に置き、位相差顕微鏡検査を実施しました。顕微鏡対物レンズ (Nikon LU Plan 50x/LWD) がフィルターを通過した光をカメラ (Andor Zyla sCMOS 4.2P) に集めました。最後に、顕微鏡対物レンズ (Olympus Plan N 20x/0.4NA) を備えた顕微鏡 (Olympus BX60) を使用して、微分干渉コントラスト画像を取得しました。

HeLa 細胞は、メルボルン大学生化学薬理学学部の Paul Gleeson 研究室と Bio21 Institute から提供されました。細胞は、10% 熱不活化ウシ成長血清 (Gibco)、1x Pen-Strep (Lonza) を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) (Lonza) で \({37}^\circ \hbox {C}\) で増殖させました。 ) 5% 二酸化炭素を含む。細胞を３５ｍｍガラス底ディッシュ上に固定する２４時間前にプレーティングし、その後４％パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、HeLa セルを調達した Paul Gleeson 研究室と、デバイスの仕様に関する有用なデータを提供した Thorlabs に感謝します。 SBS はまた、有益な議論をしてくれた Kenneth B. Crozier にも感謝します。

この研究は、オーストラリア研究評議会センターオブエクセレンス助成金 (CE200100010) を通じてオーストラリア政府から資金提供を受けました。 SBS はまた、アーンスト＆グレース・マッセイ奨学金およびオーストラリア政府研究訓練プログラム奨学金の支援にも感謝しています。

次の著者も同様に貢献しました: Shaban B. Sulejman と Niken Priscilla。

ARC Center of Excellence for Transformative Meta-Optical Systems、メルボルン大学物理学部、メルボルン、ビクトリア州、3010、オーストラリア

シャバン・B・スレイマン、ニケン・プリシラ、ルーク・ヴェーゼマン、ウェンディ・SL・リー、ティモシー・J・デイヴィス、アン・ロバーツ

ARC Center of Excellence for Transformative Meta-Optical Systems、メルボルン大学電気電子工学部、メルボルン、ビクトリア州、3010、オーストラリア

ウェンディ SL リー

メルボルン大学物理学部、メルボルン、ビクトリア州、3010、オーストラリア

ジエチオン・ルー & エリザベス・ヒンデ

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SBSとARは、TJDSBSが提案したノッチフィルターを使用するというアイデアに基づいてプロジェクトを構想し、監督しました。ARNPのサポートを受けてエッジ検出実験とともに理論的および数値的作業を実施しました。LWとWSLLは、SBSJLのサポートを受けてスペクトル測定と位相イメージング実験を実施しました。そしてEHはHeLa細胞を回収して準備しました。 SBS は LW の支援を受けてデータを処理し、原稿を作成し、著者全員がフィードバックを提供しました。

シャバン・B・スレイマンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Sulejman、SB、Priscilla、N.、Wesemann、L. 他。生物学的画像処理のプラットフォームとしての薄膜ノッチフィルター。 Sci Rep 13、4494 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-31528-5

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受信日: 2022 年 11 月 18 日

受理日: 2023 年 3 月 14 日

公開日: 2023 年 3 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31528-5

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