ゼブラフィッシュ幼生感染モデルにおける将来の応用のための非標的メタボローム研究のための抽出法の評価

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7489 (2023) この記事を引用

315 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

非ターゲットメタボロミクスにおけるサンプル前処理では、できるだけ多くの分子を再現可能に抽出できる必要があります。したがって、サンプル前処理を最適化することが重要です。この研究では、感染モデルの状況でゼブラフィッシュ幼生を抽出するのに最も適した抽出手順を見つけるために、6 つの異なる抽出手順を比較しました。メタノール (I) とメタノール/アセトニトリル/水の単一混和相 (II) を使用する 2 つの一相抽出、およびクロロホルムとメタノール/水の組み合わせ間の相分離を使用する 2 つの二相抽出 (III および IV) をテストしました。追加のビーズ均質化を方法 III および IV (III_B および IV_B) に使用しました。マイコバクテリア感染に関連する 9 つの内部標準と 59 の対象分子 (MoInt) をメソッドの評価に使用しました。二相法 (III および IV) では、一相抽出と比較して、特徴数が減少し、MoInt (特にアミノ酸) のピーク面積が増加し、変動係数が増加しました。ビーズの均質化を追加すると、フィーチャー数、ピーク面積、CV が増加しました。抽出 I は抽出 II よりも高いピーク面積と低い CV を示し、したがって最も適した 1 段階法です。抽出 III と IV は同様の結果を示しましたが、III の方が実行が容易で、不正確になりにくいです。したがって、ゼブラフィッシュ幼生のメタボロミクスおよび感染モデルにおける将来の応用には、抽出 I および III が選択される可能性があります。

メタボロミクスは、特定の時点で生物またはモデル系に存在する 1,500 Da 未満の分子 (メタボローム) の変化を分析的にプロファイルすることを目的としています 1,2。メタボロームには、内因性代謝物だけでなく、薬物などの外因性に由来する代謝物も含まれます。ターゲットを絞ったアプローチは、多くの場合、特定のグループの代謝物から選択された代謝物の定量化に基づいていますが、非ターゲットメタボロミクスは、できるだけ多くの代謝物を検出することを目的としています1、2、3。サンプル分離によく適用される分析手法には液体クロマトグラフィー (LC) とガスクロマトグラフィーがあり、どちらも定期的に質量分析計と組み合わせられます 1、2、3。非ターゲットアプローチにおける LC 分離は、多くの場合、非極性代謝物の分離には逆相カラム、極性代謝物の分離には順相カラム、または順相カラムのバリエーションとして親水性相互作用液体クロマトグラフィー (HILIC) カラムを使用して行われます。固定相の上に水層があり、主に液体と液体の分配に基づいて分離が行われます。フェニルヘキシルカラムは、芳香族分子に対する独自の選択性を備えた逆相カラムです。代謝産物の分離後、一般的にエレクトロスプレーイオン化 (ESI) または大気圧イオン化を使用して代謝産物をイオン化し、質量分析装置 (多くの場合 Orbitrap または飛行時間型装置) を使用して分析します 1,2。断片化スペクトルは、たとえばデータ依存またはデータ非依存の取得を使用した同じ分析で、またはその後の分析で生成できます。このようにして生成されたデータは、ピーク検出や前処理などのバイオインフォマティクス手法を使用してさらに処理され、続いて多変量統計によって評価され、識別のための参照ライブラリーに対する断片化スペクトルの比較が可能です1、2、3、4、5。

結核6などの病気の影響を理解し、診断や治療の成功のためのバイオマーカーを見つけるために、メタボロミクスが適用され、宿主のメタボロームの変化が観察されることがよくあります。具体的には、結核菌感染に起因する内因性メタボロームの変化が、ヒト 4、5、6、7 およびマウス、モルモット、ウサギ、およびヒト以外の霊長類 9 を含む動物モデル 8 で広範囲に研究されました。メタボロームに誘発される変化は、自然宿主の 1 つとしてゼブラフィッシュ幼生 (ダニオレリオ、ZF) の非結核性抗酸菌 M. marinum を使用して研究されました 10。 M. marinum を使用したこのような ZF モデルは、哺乳類の対応物で通常見られる肉芽腫様構造に似ています 11、12、13、14。 ZF ゲノムはヒトのゲノムと約 70% 同一であり 15、いくつかの研究では、生体異物代謝 16、17、18、19 および感染時の宿主メタボローム 20、21 の両方に関して、ヒトと同様の代謝が報告されています。 ZF 幼虫モデルには、他の生物と比較して、取り扱いの容易さ、胚と幼虫の光学的透明性、金銭的コストの低さなどのさらなる利点があります 22,23。さらに、受精後 120 時間（hpf）未満の胚および幼虫を用いて行われた実験は、欧州連合内では動物実験とみなされません（EU 指令、2010/63/EU）24。多くの利点があるため、非標的メタボロミクスを採用した ZF 研究は現在ますます一般的になっています 25,26 が、疾患や特に M. marinum の文脈ではほとんど使用されていません 20。

ZF 幼虫における M. marinum 感染モデルの実装のために行われた予備研究では、ZF 幼虫のサイズが小さいためにサンプル材料が欠如し、代謝産物のシグナル強度が低くなり、代謝産物が見逃され、再現性が低下しました。使用する方法、特にサンプル前処理の最適化が必要であると考えられました。メタボロームの十分に大きな部分をカバーするために、抽出、分離、または同定のためのさまざまな方法を組み合わせて使用することがよくあります 1、2、3、27、28。

ZF 幼生やその他の魚組織に対して一般的に使用される液体抽出は、メタノール、アセトニトリル、水など 29 またはメタノールのみ 19 などの 1 つ以上の混和性溶媒からなる一相抽出に基づいていることがよくあります。これらはまた、親油相と親水相の間の相分離を利用する、2 つの非混和性溶液 30 からなる二相法に基づいています。最も一般的な二相法では、1 つの極性溶液 (例: メタノールと水の混合物) と 1 つの非極性溶液 (例: クロロホルム 31、32、メチル tert-ブチルエーテル 33 またはヘプタン 34) が使用されます。

別のアプローチは、追加のサンプルの均質化を適用することです。一部の組織サンプルは溶媒を使用して直接抽出できますが、より耐性のある組織には追加の分解ステップが必要です。これらの方法には、メタボロームやその後の抽出プロセスに干渉する可能性があるという欠点がある化学的均質化、または幼虫を粉砕する、ビーズで叩く、または超音波処理するなどによる幼虫の機械的均質化が含まれます35。

この研究は、1 相、2 相、機械的均質化を伴う 2 相などのさまざまなサンプル抽出手順を比較し、M. marinum ZF 幼虫感染モデルでの将来の使用に最も適した手順を見つけることを目的としました。内部標準、いわゆる「対象分子」(MoInt) を含む複数の品質評価戦略に基づいてさまざまな方法が調査され、落とし穴や改善点が明らかになりました。

プロナーゼおよびメチレンブルーは、Sigma-Aldrich (Taufkirchen、ドイツ) から入手しました。 NaCl、KCl、MgSO4、Ca(NO3)2、および 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES) は、Carl Roth (カールスルーエ、ドイツ) から入手しました。トリプトファン-d5 は、Alsachim (Illkirch Graffenstaden、フランス) から入手しました。 Telmisartan-d7 は Sigma (Taufkirchen、ドイツ) から購入しました。トリミプラミン-d3、ビソプロロール-d5、フロセミド、グリベンクラミド、およびヒドロクロロチアジドは、LGC (Wesel、ドイツ) から入手しました。ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム（両方とも分析グレード）、ギ酸（LC-MS グレード）、d-グルコース-d7、およびパルミチン酸-d31 は、Merck (ダルムシュタット、ドイツ) から購入しました。アセトニトリル (ACN、LC-MS グレード)、メタノール (MeOH、LC-MS グレード)、およびその他すべての化学薬品および試薬 (分析グレード) は VWR (ダルムシュタット、ドイツ) から入手しました。クロロホルム (分析試薬グレード) は Fisher (Schwerte、ドイツ) から入手しました。脱イオン水は、Merck (ドイツ、ダルムシュタット) の Millipore システム (耐水性 18.2 Ω × cm) によって生成されました。反応チューブとピペットチップは、Sarstedt (ニュンブレヒト、ドイツ) から入手しました。酸洗浄した０．５ｍｍガラスビーズを予め充填した２ｍＬホモジナイザーチューブをＢｉｏｚｙｍ（ヘス、ドイツ）から入手した。

成体 ZF の飼育は、ドイツ動物福祉法 (§11 Abs. 1 TierSchG) に従い、以前に文書化された方法 19,36 に基づいて実施されました。 EU 指令 2010/63/EU によれば、最初の 120 hpf 以内の ZF 幼虫は動物実験とみなされません。ゼブラフィッシュの維持、胚の調製、およびサンプル調製までのサンプル収集は補足資料に記載されています。

2 つの 1 相抽出 (I ～ II) と 2 つの 2 相抽出 (III ～ IV) が調査され、抽出 I は予備実験に使用されました。二相抽出は、ガラスビーズの均質化を使用した機械的前処理と組み合わせてさらに評価されました。

結果で「_B」として示されているビーズの均質化では、充填済み均質化チューブ (Biozym、ヘス、ドイツ) からの 0.5 mm ガラスビーズを衝撃凍結サンプルに追加しました。 MP Biomedicals FastPrep24 ホモジナイザー (TF、ドライアイヒ、ドイツ) を使用して、Quick Prep モードで 6 m/s で 20 秒間サンプルをホモジナイズし、その後氷上に保管しました。抽出中に、異なる IS を含む 3 つの異なるスパイクソリューション (1、2、および 3) が使用されました。それらの含有量と IS のピークピッキング、m/z および保持時間は表 S1 にあります。

抽出 I の場合、Park ら、180 μL の MeOH および 20 μL の内部標準溶液スパイク溶液 1 (25 μg/mL トリプトファン-d5、1 mg/mL パルミチン酸-d31、50 μg/mL グルコース-d7 MeOH)を各サンプルに添加しました19。サンプルを10秒間ボルテックスし、その後4℃、21,500×gで10分間遠心分離しました。

Bai らの抽出 II では、80 μL の MeOH、100 μL の ACN、および 40 μL のミリポア水が、20 μL のスパイク溶液 1 とともに各サンプルに添加されました29。 USC 100T 超音波洗浄器 (VWR、ダルムシュタット、ドイツ) を使用してサンプルを室温で 15 分間超音波処理し、-20 °C で 2 時間インキュベートし、その後 4 °C、21,500 xg で 15 分間遠心分離しました。

Chai et al. から採用された抽出 III および III_B では、180 μL の MeOH と 80 μL のミリポア水が、20 μL のスパイク溶液 1 とともに各サンプルに添加されました37。 200 μL のクロロホルムと 100 μL のミリポア水を加え、サンプルを 1 分間ボルテックスしました。サンプルを氷上で10分間インキュベートし、その後4℃、13,800×gで10分間遠心分離しました。

Ding et al. から採用された抽出 IV および IV_B では、80 μL の MeOH と 100 μL のミリポア水が、20 μL のスパイク溶液 1 とともに各サンプルに添加されました20。 200 μL のクロロホルムを加え、USC 100T 超音波洗浄器 (VWR、ダルムシュタット、ドイツ) を使用してサンプルを 15 分間超音波処理しました。サンプルを氷上で 10 分間インキュベートし、その後 4 °C、2400 xg で 5 分間遠心分離しました。個々の抽出手順のワークフローを図 2 に示します。 1と2。

抽出手順 I および II のワークフロー。 MeOH メタノール、ACN アセトニトリル。 25 μg/mL トリプトファン-d5、1 mg/mL パルミチン酸-d31、50 μg/mL グルコース-d7 の MeOH 溶液 1 をスパイクします。 BioRender.com によって生成され、学術ライセンス条項に基づいて公開されています。

抽出手順 III (III B) および IV (IV B) のワークフロー。 MeOH メタノール、ACN アセトニトリル。 25 μg/mL トリプトファン-d5、1 mg/mL パルミチン酸-d31、50 μg/mL グルコース-d7 の MeOH 溶液 1 をスパイクします。 BioRender.com によって生成され、学術ライセンス条項に基づいて公開されています。

抽出 III、IV、III_B、および IV_B では、ESI イオン化を含む分析設定が親油性代謝物に対して最適化されておらず、対象分子および内部標準のほとんどが親水性であるため、下部の親油性相は廃棄され、さらなる分析は行われませんでした。

各抽出手順の後、各サンプルの上清を茶色のガラスバイアルに移し、-80 °C で一晩保存しました。 10 µL のスパイク溶液 2 (MeOH 中の 1 µg/mL トリミプラミン-d3 および 50 µg/mL グリベンクラミド) を加え、30 °C で真空遠心分離機 (Eppendorf, Hamburg, Germany) を使用して溶媒を除去しました。溶媒の量に応じて、真空下でのアルコール溶液の設定 (V-AL) は最大 2 時間です。その後、残渣を、0.01 μg/mL ビソプロロール-d5 およびテルミサルタン-d7、10 μg/mL ヒドロクロロチアジドおよびフロセミドを含む 50 μL MeOH/ACN (70:30 v/v) で再構成しました (スパイク溶液 3)。再構成された抽出物を 10 秒間ボルテックスし、各サンプルをオートサンプラーの入口に移しました。各サンプルの 5 μL をプールし、QC サンプルとして使用しました。サンプルは施設間の輸送のためにドライアイス上に維持され、分析まで -80 °C で保管されました。

LC-HRMS/MS 分析は以前の出版物 36、38 に基づいて実施されており、機器の詳細は補足資料に記載されています。簡単に説明すると、使用した装置は、脱気装置、四次ポンプ、UltiMate オートサンプラーを含む Thermo Fisher Scientific Dionex UltiMate 3000 RS ポンプと、TF Q-Exactive Plus (TF、ドライアイヒ、ドイツ) を組み合わせたものでした。イオン源は加熱エレクトロスプレーイオン化 HESI-II 源でした。 HESI-II ソースのパラメータは、以前の方法 36 に従って選択されました。

逆相 (RP) クロマトグラフィーは TF Accucore Phenyl-Hexyl カラム (100 mm × 2.1 mm、2.6 μm、TF、ドライアイヒ、ドイツ) で実行し、親水性相互作用液体クロマトグラフィー (HILIC) は Nucleodur カラム (125 mm × 3 mm) を使用して実行しました。、3μm、Macherey-Nagel、デューレン、ドイツ）。

TF raw ファイルは、TF Xcalibur ソフトウェアバージョン 4.1 を使用して、すべての IS および MoInt の保持時間、ピーク強度、およびピーク形状について分析され、正しい検出、識別、および検出器の飽和の可能性が確認されました。その後、ProteoWizard39 を使用して生ファイルを mzXML ファイルに変換しました。ピークピッキングは、R 環境で XCMS を使用して実行されました40。さらに、CAMERA パッケージ 41 を使用して、検出されたピークに同位体、付加物、アーティファクトとして注釈が付けられました。 XCMS パラメータの最適化は、以前に公開された方法 42 に基づいて行われました42。最適化されたピークピッキングおよびアライメントパラメータは表 S2 にあります。サンプル全体のピークを選択して個々の特徴にグループ化した後、プールされた QC サンプルの繰り返し測定を使用して特徴領域がバッチ補正されました 43。

特徴数は、一元配置分散分析 (ANOVA) と、XCMS を使用した以前に公開された方法 42 に基づくウェルチの 2 サンプル t 検定を使用して決定および分析され、抽出 II、III および IV と I、III と III_B、および IV と IV_B を比較しました。それぞれ。

評価スクリプトから取得した内部標準 (IS) と MoInt のピーク面積に基づいて、平均値、標準偏差、CV の値を Excel で計算し、GraphPad PRISM 9 を使用して図を作成しました。さらに、Manier と Meyer42 に基づいて、内部標準および MoInt のピーク面積は、ANOVA および Welch の 2 サンプル t 検定を使用して分析され、すべての抽出を抽出 I と比較しました。抽出 I は、以前に他のメタボロミクス研究で成功裏に使用されていたため、参照方法とみなされました 19。予備実験でも。

生成されたデータセット全体に ANOVA を適用し、ボンフェローニ補正 44 を使用して偽陽性結果を補正し、6 つの異なるサンプルグループ間で大きく異なる分子または特徴を決定しました。抽出方法間のグループごとの違いを調査するために、有意な特徴を使用して主成分判別関数分析 (PC-DFA) を実行しました。主成分分析の前に、データセットが中心化され、その後の判別分析では、少なくとも 2 つの成分でカイザーの基準を満たす成分が使用されました。予測の品質は、モンテカルロ交差検証 45 を使用して決定されました。

生データファイルは、研究識別子 MTBLS6046 で MetaboLights (https://www.ebi.ac.uk/metabolights/) にアップロードされます。 R でのデータ前処理と統計分析の評価スクリプトは、Github (https://github.com/PhilSchip/zebrafish_extraction) にあります。

MoIntには59分子が含まれており、主にゼブラフィッシュやその他の種を用いたマイコバクテリア感染モデルで大幅に変化していることが判明した宿主代謝物と、擬似標的アプローチの一形態としてこの研究の前に行われた予備感染実験からの代謝物が含まれていた。この論文では抽出方法を採用したため、感染研究に関係のない追加の研究 37 からの代謝物が含まれています。

m/z と保持時間に基づいて、Sumner46 が提案した分類システムを使用して、識別レベル 2 の MoInt を未知の化合物として分類するのではなく、推定的にアノテーションが付けられた化合物として識別するために、プールされた QC サンプルで並行反応モニタリングが実行されました。データファイルは ProteoWizard39 を使用して mzXML 形式に変換され、NIST MS Search 2.3 にインポートされました。化合物の同定には、ヒトメタボロームデータベース (hmdb)、NIST14 (nist_msms および nist_msms2 サブデータベース)、Wiley METLIN 質量スペクトルデータベース (metlin_insilico およびmetlin_experimental サブデータベース) の 3 つの異なるデータベースが使用されました。以前の出版物 36 に基づく次のパラメータがライブラリ検索に使用されました。スペクトル検索タイプ、アイデンティティ (MS/MS)。前駆体イオン m/z、スペクトル。事前検索、オフ。 MS/MS パラメーターは次のとおりです。設定: 前駆体許容値、± 5 ppm。プロダクトイオン許容差、±10 ppm。

検出された対象分子の生物学的関連性を判断するために、Metaboanalyst47 のバージョン 5.0 を使用した経路解析が実施されました。各 MoInt の HMDB ID を識別子として使用し、対応する KEGG 識別子に接続し、KEGG48、47、50 の Danio Rerio 経路ライブラリーに対して分析しました。 HMDB ID のない 3-ケトコレステロール、KEGG ID のない 3-メトキシチロシン、ステアロイルエタノールアミド、およびジメチルアルギニンでは、31 をこの分析に使用できます。分析は、視覚化方法として散布図、濃縮方法として超幾何テスト、トポロジー分析のための相対的中心性を使用し、さらに参照メタボロームとしてパスウェイライブラリーのすべての化合物を使用して実行されました。

4 つの異なる抽出方法は、まず特徴数に基づいて分析されました。品質の分析パラメーターとしての特徴数は、ターゲットを絞ったアプローチではあまり関連性がありませんが、ターゲットを絞っていないメタボロミクスでは有用な代用となる可能性があります。擬似標的アプローチの結果には影響しませんが、メタボローム全体のカバー範囲とよりよく相関するため、必要だが標的にされていない代謝物を検出できる可能性が高くなります。図 3 に示すように、抽出 I および II では、2 段階の方法 III および IV と比較して、より多くの特徴を検出できました。相分離中に親油性代謝産物が失われるため、この観察は予想されており、廃棄された親油性抽出物に対する親油性物質専用の方法を使用して回避できました。唯一の例外は、陽イオン化モードを使用したフェニル-ヘキシルカラムでの分析で、II、III、IV がすべて増加しました。抽出 II および IV では、超音波処理、つまりサンプルの高度な均質化によってこの効果が説明される可能性がありますが、これは抽出 III には当てはまりません。他の実験を観察すると、超音波処理のそのような効果は観察されませんでした。したがって、現時点では説明ができません。

検出された特徴の数。統計的評価は、各グループを抽出 I と比較する、一元配置 ANOVA およびウェルチの 2 サンプル t 検定を使用して実行されました。(A) フェニル-ヘキシルカラム、陽イオン化。 (B) フェニル-ヘキシルカラム、陰イオン化。 (C) HILIC カラム、陽イオン化。 (D) HILIC カラム、負イオン化。 ns は重要ではありません。 *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001。各サンプルグループの n = 5。

この例外とは別に、抽出 I と II は非常に類似した特徴数を示しましたが、分析の極性に基づいて、方法 III と IV は異なりました。抽出 IV は正イオン化後 (A および C)、抽出 III は負イオン化後 (B および D)、それぞれ高い特徴数を示しました。

一般に、正イオン化モードでは負イオン化モードよりも多くの特徴を検出でき、それぞれ約 600 ～ 1300 の特徴に対して約 2200 ～ 6000 の特徴が検出されました。 HILIC カラムを使用した後の分析では、フェニル-ヘキシルカラムを使用した後の分析よりも特徴が半分未満しか示されていないことも観察されました。

機械的前処理を使用すると、実行されたすべての実行で特徴数が大幅に増加しました (図 4)。これは、サンプルの均質化が成功したことを示しており、これにより、より多くの幼虫組織が破壊され、より多くの代謝物が抽出のために放出されます。

これらの結果に基づくと、二相法では特徴が見逃されていますが、これはおそらく、親水性物質と親油性物質からの分離とその後のそれらの親油性物質の廃棄が原因であると考えられます。抽出物自体に含まれる干渉分子は少なくなるはずですが、関連する特徴が欠落する可能性が問題となります。ビーズの均質化の使用では、その逆が示されました。フィーチャ数が多いほど (場合によっては 1 相抽出と同等かそれ以上)、カバレッジが向上し、干渉分子の可能性が高くなります。

いずれの結果も、慎重に扱う必要があります。同位体、付加体形成、断片化などの内因性信号と、汚染物質、ノイズ、データ処理エラーなどから生じる人工信号 51 の両方が、測定された特徴数の大幅な変動につながる可能性があります。

ただし、この研究では、各サンプルグループのばらつきが小さいこと、およびグループごとに 5 回の繰り返し抽出によるランダムな誤った信号の補正により、これらの結果の信頼性が高くなります。これらの変動が観察された違いに何らかの役割を果たしている可能性はありますが、主要な部分を占める可能性は低いと思われます。

これらの結果は、各抽出原理間の違いを示していますが、同じ原理を使用する方法では、予想どおり、すべての特徴にわたってより近い結果が示されています。これらの違いが将来の感染モデルに関連するのか、それとも M. marinum 感染の調査に無関係な分子のみに影響を与えるのかは、現時点では不明です。違いとその関連性をさらに評価するために、M. marinum 感染モデルの抽出手順の将来の適用に関する科学的背景に基づいて選択された内部標準と MoInt を次の手順で分析しました。

使用した内部標準は、抽出開始時 (スパイク 1)、蒸発前 (スパイク 2)、または再構成中 (スパイク 3) での添加に基づいて 3 つの別々のグループに分類できます。使用したカラムとイオン化に応じたピークピッキングの成功率、および保持時間と m/z を表 S1 に示します。注目に値するのは、トリプトファン d5 とグルコース d7 が HILIC カラムと負イオン化モードを使用しても検出されなかったという事実です。これはおそらく強度が非常に低いためであり、さらにグルコース d7 の場合は特徴的でない広いピーク形状のためでした。負イオン化後、特に HILIC 後の IS 強度の低下は回避できませんでした。 HILIC 後のグルコース d7 のピーク形状は、クロマトグラフィーの最適化の必要性を示していましたが、MoInt における糖類の関連性が低く、RP 後の検出品質が十分であるため、この研究では最適化は行われませんでした。クロマトグラフィー。

検出された各内部標準のピーク面積は、抽出 I を使用して平均ピーク面積で正規化され、すでに確立された方法であるため参照標準として使用されました。これらの正規化されたピーク面積は図 3 と図 4 に示されています。 S2～S5。それぞれの CV 値は図 1 と図 2 に示されています。 S6～S9。さらに、Welch の 2 つのサンプル t 検定を実行し、抽出 II、III、IV のピーク面積を抽出 I と比較しました。結果として得られた有意差を表 S3 ～ S6 にまとめます。

トリプトファン D5 のピーク面積は、抽出 IV を除き、抽出法間で非常に類似しており、抽出 IV では 3 回の分析実行すべてで顕著な減少が見られました。

グルコース-d7 は、フェニル-ヘキシルカラムと負イオン化モードを使用した場合にのみ検出でき、抽出 II の増加を除いて、非常に類似したピーク面積が観察されました。

パルミチン酸-d31 は、一相法と二相法の間で有意な差を示しました。おそらく長鎖脂肪酸として親油性が高いため、二相法を使用した回収はほとんど存在しませんでしたが、抽出 I と II は同等にパルミチン酸 d31 を抽出できました。

マイナスイオン化を使用すると、抽出 II、III、IV の HILIC カラム上のグリベンクラミドのピーク面積が低いことを除けば、スパイク 2 と 3 の他の 6 つの試験された内部標準のピーク面積は抽出間で非常に類似していました。ただし、陽イオン化の場合、フェニルヘキシルカラムのグリベンクラミドとトリミプラミン d3、同じ IS、ビソプロロール d5 とテルミサルタン d7 で傾向が観察され、抽出 IV のピーク面積が最も低く観察されました。これらの IS は蒸発と再構成の直前に追加されたものであり、これらの違いはこの時点以降でのみ発生します。他の分子からの干渉に加えて、真空蒸着時間が長くなることが強度損失の要因となる可能性があります。一方、スパイク溶液 3 に含まれるビソプロロール d5 およびテルミサルタン d7 についても同様の効果が観察され、これらは再構成溶液に添加されましたが、それは HILIC ベースの分析の前にのみでした。したがって、LC 実行中のこれらの IS と他の分子との相互作用、または使用したシラン処理されていない茶色のガラスバイアルへの付着の可能性が高くなります。

CV に関しては、大多数が 5 ～ 20% の間でした。例外として、ピーク面積が非常に低いため二相抽出のパルミチン酸 d31、抽出 IV のグルコース d7、抽出 II を使用する HILIC カラムのグリベンクラミドおよびビソプロロール d5 が含まれます。

全体として、すべての抽出方法は比較的低い CV 値を示し、抽出 II の精度が最も悪く、トリプトファン D5 の回収率に基づいて抽出 IV よりも抽出 III が優先されました。

フロセミドのピーク面積の大幅な増加 (マイナスイオン化、フェニルヘキシルカラム) のほかに、IS のピーク面積の大きな変化は観察できませんでした。機械的前処理により、HILIC カラム (陽イオン化) での抽出 IV_B を除き、トリプトファン d5 の CV が全体的に増加しました。これは、約 2% ポイントの減少を示しましたが、グルコース d7 は、メソッドを使用して増加を示しました。 III と、方法 IV を使用した場合の減少は同程度です。

選択した分析問題に関連する可能性のある抽出方法間の違いをさらに評価するために、いわゆる MoInt の包括的なライブラリが使用されました。表 S7 に示すように、文献と社内の予備実験に基づいて、合計 59 の MoInt が評価のために選択されました。得られたピークを検出して手動で評価した後、正イオン化と負イオン化を使用して、それぞれこのリストの 34 個と 16 個の分子が残りました。通常、濃度応答曲線のダイナミックレンジ内で標的分子を確実に分析できるように、定量的かつ標的を絞ったアプローチについてキャリブレーション範囲を事前にテストします。このアプローチは、可能性のある未知のターゲットが広範囲に及ぶため、非ターゲットのアプローチには実行できません。この研究と今後計画されている感染研究では、標的分子の濃度を定量化することなく、異なるサンプルグループ間の MoInt の相対量のみを比較する定性的アプローチが採用されています。それにもかかわらず、検出器の飽和は、ターゲットを絞っていない定性的研究でも問題になる可能性があります。現在の研究に関連してこの効果を評価するために、すべての MoInt および IS のピーク形状と強度を TF Xcalibur ソフトウェアを使用して手動で分析しました。信号は、不規則で平坦なピーク形状、または特に高い信号強度などの飽和の兆候について評価されました。この研究のデータでは、これらの影響はいずれも観察されませんでした。したがって、分析された MoInt および IS に関して、得られたデータは堅牢であると考えられる必要がありますが、将来の非ターゲットのメタボロミクス研究では、追加の希釈実験やより多量の基質 (この場合はゼブラフィッシュ) を用いた実験によって飽和効果を除外する必要があることを認識する必要があります。幼虫）。

検出に成功したこれらの MoInt、その化合物サブグループのリスト、および各カラムでの検出、包含パラメーター、およびプールされた QC サンプルのフォローアップ PRM 実行で生成されたスペクトルに基づく同定ステータスのリストを、表 1 に示します。正イオン化モードについては表 2、負イオン化モードについては表 2 を参照してください。

内部標準のピーク面積 (セクション 3.1.2 を参照) と同様に、検出された各 MoInt のピーク面積は抽出 I の平均ピーク面積で正規化され、各抽出の平均とその標準偏差は次のように計算できます。図1および2に見られます。 S10 ～ S13。抽出物 II、III、IV を抽出物 I と比較するウェルチの 2 サンプル t 検定の結果を表 S8 ～ S11 に示します。

4 回の分析実行すべてにおいて、ほとんどの MoInt は、抽出 I、特に抽出 I に最も密接に関連する方法である抽出 II のピーク面積とほぼ等しいピーク面積で検出されました。二相抽出法の使用により、ピーク面積が大幅に減少しました。最も顕著なのは、3-ケトコレステロール、N-パルミトイル-d-スフィンゴシン、イノシン酸です。対照的に、広範囲の分子、特にアミノ酸が大幅に増加しました。回収率の低下は、影響を受けた MoInt の親油性に基づいて説明できますが、アミノ酸のピーク面積の増加は、複数の要因に起因する可能性があります。たとえば、全体的に高い回収率、同様の m/z および保持時間の値での干渉シグナルの数が多いなどです。、またはより少ない量の分子が、MoInt のイオン化を妨げます。

フェニルヘキシルカラムを使用する場合、ほとんどのアミノ酸が最初の 60 秒以内に非常に早く溶出するため、特に多数の干渉分子が重要な役割を果たす可能性があります。

要約すると、二相抽出には MoInt 回収率が高いという利点があるようで、方法 III と方法 IV はどちらも非常に似た結果を示しました。単相抽出に関しては、特徴の回復に関して、抽出 I が最も有望であると思われます。各抽出のすべての MoInt に関するこれらの結果を要約すると (図 5)、単相法の方が全体的にピーク面積がはるかに低く、負イオン化を使用したフェニル-ヘキシルカラムを除いて、抽出 II が最も低い回収率を示したことがわかりました。抽出 III と IV は非常に類似した結果を示しました。標準偏差を見ると、抽出 I が最高の精度を示しましたが、抽出 II は全体的に精度が低く、フェニルヘキシルカラムでの抽出 II と陽イオン化を除き、両方の 2 相法で標準偏差が最高、精度が最低でした。

各抽出手順の正規化されたピーク面積の平均とそれぞれの標準偏差。各サンプルグループの n = 5。 (A) フェニル-ヘキシルカラム、陽イオン化。 (B) フェニル-ヘキシルカラム、陰イオン化。 (C) HILIC カラム、陽イオン化。 (D) HILIC カラム、負イオン化。

個々の MoInt の精度を視覚化するために、それぞれの CV 値を図に示します。 S14～S17。ほとんどの CV は 5 ～ 25% でした。プラスイオン化を利用すると、マイナスイオン化に比べてより正確な結果が得られます。これは、少なくとも部分的には、ネガティブランにおけるほとんどの分析対象物、特にプラスイオン化とマイナスイオン化の両方で検出される分析物の全体的な強度が低いためです。抽出 II は、平均して最も高い CV 値と、非常に高い偏差を持つほとんどの分子を示しましたが、抽出 III および IV は、抽出 I と比較して、ほぼ同等かわずかに高い CV 値を示しました。より高い CV 値の一部は、前述の CV 値の影響をさらに受けました。親油性分子の回収率が低い。抽出 I は単相抽出で最も正確な結果を示しましたが、抽出 III は負イオン化についてはわずかに低い CV を、正イオン化については抽出 IV がそれぞれわずかに低い CV を示しました。

抽出物 III および IV のピーク面積を、前処理を追加した対応物 (抽出物 III_B および IV_B) と比較したものを図 2 および図 3 に示します。補足資料のS18～S21。図 6 に要約すると、前処理を行った両方の抽出では、平均して MoInt ピーク面積の増加が示されました。抽出 III_B は、IV_B と比較して、負イオン化のピーク面積が高く、正イオン化のピーク面積が同等かわずかに低いことを示しました。より高いピーク面積には、より高い、またはほぼ等しい標準偏差が伴いました。個々の MoInt の CV には明確な傾向はありませんでした (図 S22 ～ S25)。抽出 IV_B は III_B よりも高い CV をもたらし、平均すると、機械的前処理の有無にかかわらず、それぞれの抽出間で CV は同様でした。要約すると、ビーズの均質化により、均質化を追加しない場合と同等の精度を維持しながら、MoInt の回収率が増加しました。

各抽出手順の正規化されたピーク面積の平均とそれぞれの標準偏差。各サンプルグループの n = 5。 (A) フェニル-ヘキシルカラム、陽イオン化。 (B) フェニル-ヘキシルカラム、陰イオン化。 (C) HILIC カラム、陽イオン化。 (D) HILIC カラム、負イオン化。ビーズのホモジナイズを追加した場合は「_B」と表記しました。

この研究で検出された 35 個の MoInt のうち、31 個は KEGG データベースで見つかりましたが、MoInt ケトコレステロール、3-メトキシチロシン、ステアロイルエタノールアミド、およびジメチルアルギニンは欠落しており、これらはまったく未調査の代謝産物である可能性が高くなります。 3-ケトコレステロールとステアロイルエタノールアミドは社内の予備実験に由来するため、ZFにおけるマイコバクテリウム・マリヌム感染症と暫定的にのみ関連付けられていますが、3-メトキシチロシンとジメチルアルギニンは別の研究でZFにおけるマイコバクテリウム感染症と関連付けられています20。

MoInt の経路解析の概要を図 7 に示します。合計 33 の経路が見つかり、そのほとんどが特定の分子の代謝、たとえばトリプトファン、ビオチン、またはフェニルアラニンの代謝に関連していました。すべての経路の概要は表 S12 にあります。これら 33 の経路のうち、9 は 0.01 以下の p 値を示し、MoInt と経路の強い相関関係を示しています。アミノアシル tRNA 生合成は、最も高い量の相関 MoInt を示しました。これは、アミノ酸グループが検出された MoInt の最大のグループであり、したがってこの経路のアミノアシル tRNA 生合成部分の前駆体であるという事実に完全に基づいています。ただし、関連する影響スコア 0.00 は非常に低かったです。より関連性が高いのは、高いインパクト値と低い p 値を組み合わせた経路です。このような経路は、tRNA 生合成後に最も低い p 値を示し、中程度の影響を示すアルギニン生合成とリジン分解であり、一方、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンの生合成と、アラニン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸の代謝は最も高い影響を示しました。したがって、他の経路および代謝全体に関連し、関連している可能性が最も高くなります。

検出されたすべての MoInt の経路分析の概要。影響および調整された p 値によって最も関連性の高い経路を特定します。パスウェイのインパクトは、中心性とパスウェイの強化の組み合わせとして計算され、インパクト値はパスウェイの相対的な重要性と正の相関関係があります。円の色は重要性 (白から赤に増加) を示し、円のサイズは経路への影響を示します。結果は Metaboanalyst バージョン 5.0 を使用して生成されました。

要約すると、この研究で検出および分析されたMoIntは、さまざまな影響を与えるいくつかの経路に関連している可能性があり、それらのほとんどで証明されたマイコバクテリア感染症との相関関係と組み合わせることで、選択されたMoIntは、さまざまな異なる感染症を対象とする将来の感染症研究に役立つ可能性があります。代謝経路。

各抽出手順で検出されたメタボローム全体を、一元配置分散分析を使用して分析しました。任意の 2 つのグループ間で有意な差を示した特徴は、多変量統計のために保持されました。 Phenyl-Hexyl カラムを使用した分析後の 3016 と 638 の特徴、および正および負のイオン化にそれぞれ HILIC カラムを使用した分析後の 713 と 202 の特徴が大きく異なりました。これらの数値を前述の総フィーチャー数と比較すると、全フィーチャーの約 50% がフェニル-ヘキシルカラムで重要であり、約 30% が HILIC カラムで重要でした。これは、抽出手順の変更によりフェニルヘキシルカラムがより影響を受けることを示しています。この現象には 2 つの影響が考えられます。まず、異なるカラムでの分離に基づいて分子の検出能力が異なるため、抽出の影響を受けない分子が HILIC カラムで検出されるか、またはその逆になります。第 2 に、異なる分子間の相互作用 (たとえば、イオン化や干渉シグナルの消光など)。これは、フェニル-ヘキシルカラムの最初の 1 分間に特に関連します。 MoInt 内のほとんどのアミノ酸と検出された多くの分子がこのウィンドウで検出され、これらの相互作用の可能性が高まり、多数の分子の変動性が増加しました。同様の数の分子が抽出プロセスによって直接影響を受ける可能性がありますが、フェニルヘキシルカラムでの共溶出により、検出されたメタボロームへの影響が高まる可能性があります。

以下の図２〜図５のＰＣ−ＤＦＡである。図８および９は、一相抽出（ＩおよびＩＩ）、二相抽出（ＩＩＩおよびＩＶ）、および機械的前処理を伴う二相抽出（ＩＩＩ＿ＢおよびＩＶ＿Ｂ）間の良好な分離を示した。唯一の例外はフェニル-ヘキシルカラムと陽イオン化であり、III_B と IV は非常に似ています。これは、III_B のビーズ均質化と IV の超音波処理の同様の効果を示している可能性がありますが、これは他の結果によって裏付けられていません。

一元配置分散分析によって特定された重要な特徴を使用する PC-DFA。 (A) フェニル-ヘキシルカラム、陽イオン化モード。 (B) フェニル-ヘキシルカラム、負イオン化モード。使用された主成分の数、予測精度、およびコーエンのκが提供されます。各サンプルグループの n = 5。クラス間距離を最大化するための判別関数 (DF1 および DF2) を、クラス内距離を最小化するための判別関数 (DF1 および DF2) をそれぞれ x 軸および y 軸としてプロットしました。ビーズのホモジナイズを追加した場合は「_B」と表記しました。

一元配置分散分析によって特定された重要な特徴を使用する PC-DFA。 (A) HILIC カラム、陽イオン化。 (B) HILIC カラム、負イオン化。使用された主成分の数、予測精度、およびコーエンのκが提供されます。各サンプルグループの n = 5。クラス間距離を最大化するための判別関数 (DF1 および DF2) を、クラス内距離を最小化するための判別関数 (DF1 および DF2) をそれぞれ x 軸および y 軸としてプロットしました。ビーズのホモジナイズを追加した場合は「_B」と表記しました。

抽出 I と II、および III_B と IV_B はすべての実行で明確に分離されましたが、抽出 III と IV は HILIC カラムでは明確に分離されませんでした。これは、メタボロームの範囲が非常に類似していることを示しており、したがって、抽出の違いによる有意な影響はありません。 2つの方法。機械的な前処理を追加すると分離も追加されるため、一貫した効果は観察されません。

要約すると、前述の例外に加えて、6 つの抽出すべてでメタボローム全体の異なる範囲が示され、これは抽出手順の違いが異なる重みを持つことを示しています。相分離とビーズの均質化は、抽出溶媒、インキュベーション時間、または超音波処理の追加などの他の要因の変化よりもはるかに劇的な方法で抽出を変化させるようです。

テストしたサブグループ間でいくつかの違いが観察できました (表 3)。ビーズの均質化を行わない二相抽出では特徴数が最も少なく、他のグループも同様の数を示しました。この研究では、抽出 II の回収率が最も低く、次に抽出 I が続きました。どちらの 2 相抽出でも回収率は高く、ビーズの均質化によってさらに回収率が向上しました。最低の CV 値、したがって最高の精度は抽出 I で見られ、両方の 2 相抽出で平均してわずかに高い CV が示され、ビーズの均質化後にはさらに増加しました。この研究では、さまざまな抽出物が比較されました。 1 相抽出では全体的により多くの特徴が検出され、特にアミノ酸に関して、MoInt の特徴領域は抽出 III および IV と比較してほとんどの場合低くなりました。パルミチン酸-d31 と同様に少数の MoInt のみが減少しましたが、これはおそらくそれらの親油性と、二相抽出における親油性クロロホルム分配での結果としての除去によるものと考えられます。 MoInt の CV は、一相法、特に抽出 I の場合に低く、全体的な精度と再現性が優れていることを示しています。ガラスビーズを使用してさらに幼虫を均質化すると、特徴数と MoInt の回収率が増加しましたが、精度はわずかに低下しました。したがって、より高い回収率と特徴数の利点がより不正確な結果を上回る場合、ビーズの均質化は将来可能な最適化となる可能性があります。要約すると、MoInt のピーク面積が全体的に高く、それらのピーク面積の CV が低く、同様の特徴数、および実験プロセスが容易であることに基づいて、抽出 I が抽出 II よりも優先されるはずです。抽出 III と IV は、MoInt については同様のピーク面積と CV を示しましたが、負イオン化を使用した場合、抽出 III はより高い特徴数を示し、実験プロセスが容易になり、トリプトファン d5 のピーク面積がより高くなりました。

感染モデル自体を含むさらなる実験を実行する必要があり、この研究で最良の結果を示した方法 I と III の両方をより詳細に比較する必要があります。より堅牢なデータセットを得るには、使用するサンプルの数を増やし、実験を繰り返し、さらに他の内部標準や追加の MoInt を含める可能性もあります。

現在の研究中に生成されたデータおよび/または研究中に分析されたすべてのデータが公開されているわけではありませんが、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

Barnes, S. et al. メタボロミクス研究のトレーニング。 I. 実験を計画し、サンプルを収集および抽出し、メタボロミクスデータを生成します。Ｊ．マススペクトル。 51、461–475 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, X. & Locasale、JW メタボロミクス: 入門書。トレンド生化学。科学。 42、274–284 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Naz, S.、Vallejo, M.、Garcia, A. & Barbas, C. 非ターゲットメタボロミクスに関わるメソッド検証戦略。Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． A 1353、99–105 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cho, Y. 他標的メタボロミクスアプローチを使用した活動性肺結核の血清バイオマーカーの同定。科学。議員 10、3825 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フレディアーニ、JK 他。ヒト肺結核疾患における血漿メタボロミクス: パイロット研究。 PLoS One 9、e108854 (2014)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

フリーリング、F.ら。診断時および抗生物質治療中の 2 型糖尿病を併発している場合と伴わない結核患者における血漿メタボロミクス。科学。議員9号、18669号（2019年）。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou、A.ら。 (1)h NMR分光法に基づくメタボロミクスの結核患者血清への応用。Ｊ．プロテオームＲｅｓ． 12、4642–4649 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Broussard, GW & Ennis, DG Mycobacterium marinum はメダカに長期慢性感染症を引き起こす: ヒト結核を研究するための新しい動物モデル。コンプ。生化学。生理。 C 毒性。薬理学。 145、45–54 (2007)。

論文 PubMed Google Scholar

Myllymäki, H.、Niskanen, M.、Oksanen, KE & Rämet, M. 結核研究における動物モデル - 牛肉はどこにありますか? 専門家の意見。ドラッグディスコブ。 10、871–883 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

Takaki, K.、Davis, JM、Winglee, K. & Ramakrishnan, L. ゼブラフィッシュにおける Mycobacterium marinum 感染症の病因と治療の評価。ナット。プロトック。 8、1114–1124 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Bouz, G. & Al Hasawi, N. 結核のゼブラフィッシュモデル - 肺は必要ありません。クリティカル。 Rev.Microbiol. 44、779–792 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Tobin, DM & Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum と Mycobacterium tuberculosis の病因の比較。細胞。微生物。 10、1027–1039 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

van der Sar、AM、Appelmelk、BJ、Vandenbroucke-Grauls、CM & Bitter、W. 縞模様の星: 感染モデルとしてのゼブラフィッシュ。トレンド微生物。 12、451–457 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

van Leeuwen, LM、van der Sar, AM & Bitter, W. 結核の動物モデル: ゼブラフィッシュ。コールドスプリングハーブ。視点。医学。 5、a018580 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

ハウ、Ｋ．ら。ゼブラフィッシュの参照ゲノム配列とそのヒトゲノムとの関係。ネイチャー 496、498–503 (2013)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

デ・ソウザ・アンセルモ、C. 他ゼブラフィッシュ (ダニオ・レリオ) はヒトのような代謝研究のためのツールですか? 薬物検査アナル。 9、1685–1694 (2017)。

論文 PubMed Google Scholar

カリフォルニア州マクレーとRTのピーターソン創薬ツールとしてのゼブラフィッシュ。ナット。 Rev.DrugDiscov. 14、721–731 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

de Souza Anselmo, C.、Sardela, VF、de Sousa, VP & Pereira, HMG ゼブラフィッシュ (ダニオ・レリオ): ヒトにおける生体異物の代謝を予測するための貴重なツール? コンプ。生化学。生理。 C 毒性。薬理学。 212、34–46 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Park, YM、Meyer, MR、Muller, R. & Herrmann, J. 薬物投与経路は、ゼブラフィッシュ幼生モデルにおける合成カンナビノイドの代謝に影響を与えます。分子 25、4474 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ディン、Ｙら。結核は、ヒト患者、マイコバクテリアに感染したマウス、ゼブラフィッシュ幼生に高度に保存された代謝変化を引き起こします。科学。議員 10、11635 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gomes, MC & Mostowy, S. ゼブラフィッシュにおけるヒト感染モデルの事例。トレンド微生物。 28、10–18 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

チームー、T. 他生物医学モデルとしてのゼブラフィッシュ (ダニオ・レリオ) の使用。アニム。フロント。 9、68–77 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Ali, S.、Champagne, DL、Spanek、HP & Richardson、MK ゼブラフィッシュの胚と幼虫: 新世代の疾患モデルと薬物スクリーニング。先天異常研究 C Embryo Today 93、115–133 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Strähle, U. et al. 動物実験の代替としてのゼブラフィッシュ胚 - 動物福祉規制における保護されたライフステージの開始の定義に関する解説。リプロド。有毒。 33、128–132 (2012)。

論文 PubMed Google Scholar

Myllymaki、H. et al. 非標的メタボローム解析により明らかになった前腫瘍発生における代謝変化。フロント。セル開発バイオル。 9、684036 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ダ・シルバ、KMら。質量分析に基づくゼブラフィッシュのトキシコメタボロミクス: 分析およびデータ品質の課題のレビュー。代謝物 11、635 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Lelli, V.、Belardo, A.、Timperio, AM メタボロミクス - 医療科学および生命科学における方法論と応用 (IntechOpen、2021)。

Google スカラー

Schrimpe-Rutledge、AC、Codreanu、SG、Sherrod、SD、McLean、JA ターゲットを絞らないメタボロミクス戦略 - 課題と新たな方向性。混雑する。社会質量スペクトル。 27、1897 ～ 1905 年 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bai, X. et al. メタボロミクスとリピドミクスの統合解析により、グルカゴン受容体欠損ゼブラフィッシュにおける脂質代謝とアミノ酸代謝のリモデリングが明らかになりました。フロント。セル開発バイオル。 8、605979 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

ギル、A.ら。 1 相抽出と 2 相抽出: 血漿サンプルの非標的リピドミクスのためのサンプル前処理手順の再評価。アナル。バイオアナル。化学。 410、5859–5870 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bligh, EG & Dyer, WJ 総脂質抽出および精製の迅速な方法。できる。Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．生理。 37、911–917 (1959)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Folch, J.、Lees, M. & Sloane Stanley, GH 動物組織から総脂質を単離および精製する簡単な方法。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 226、497–509 (1957)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Matyash, V.、Liebisch, G.、Kurzchalia, TV、Shevchenko, A. & Schwudke, D. ハイスループットリピドミクスのためのメチル-tert-ブチルエーテルによる脂質抽出。Ｊ．脂質Ｒｅｓ． 49、1137–1146 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Löfgren, L.、Forsberg, GB & Ståhlman, M. BUME 法: 動物組織の総脂質抽出のための、クロロホルムを使用しない新しい迅速かつ簡単な方法。科学。議員 6、27688 (2016)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

バーデン、DW 生物サンプルの破壊に関するガイド。（ランダムプライマー、2012）。

Manier, SK、Wagmann, L.、Flockerzi, V. & Meyer, MR HepaRG 細胞インキュベートで非標的メタボロミクスを用いて研究された新しい精神活性物質 α-PBP および α-PEP のトキシコメタボロミクスにより、予期せぬアミノ酸付加物が明らかになりました。アーチ。有毒。 94、2047–2059 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chai, T. et al. 胚および幼虫におけるキラル PCB 91 および 149 の毒性試験 (Danio rerio): UPLC-MS/MS による標的メタボロミクスの応用。科学。議員第 6 号、33481 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Manier, SK、Keller, A. & Meyer, MR 非ターゲットメタボロミクスの変動係数とパラメータースイープを使用して、液体クロマトグラフィー - 質量分析データのピークピッキングを改善するための XCMS パラメーターの自動最適化。薬物検査アナル。 11、752–761 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Adusumilli, R. & Mallick, P. ProteoWizard msConvert によるデータ変換。方法Ｍｏｌ．バイオル。 1550、339–368 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Rコアチーム。 R: 統計コンピューティングのための言語および環境。 (R 統計コンピューティング財団、オーストリア、ウィーン、2022)。

Kuhl, C.、Tautenhahn, R.、Böttcher, C.、Larson, TR & Neumann, S. カメラ: 液体クロマトグラフィー/質量分析データセットの化合物スペクトル抽出と注釈のための統合戦略。アナル。化学。 84(1)、283–289。 https://doi.org/10.1021/ac202450g (2012)。

Manier, SK & Meyer, MR 非標的メタボロミクス研究における蒸発生体サンプルの再構成効率に対する使用溶媒の影響。メタボロミクス 16, 34 (2020).

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wehrens, R. et al. 非ターゲット MS ベースのメタボロミクスにおけるバッチ補正が改善されました。メタボロミクス 12(5)、88。https://doi.org/10.1007/s11306-016-1015-8 (2016)。

Bland、JM および Altman、DG 多重有意性検定: Bonferroni 法。 BMJ 310、170 (1995)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Landis, JR & Koch, GG カテゴリカルデータの観察者一致の測定。バイオメトリクス 33、159–174 (1977)。

論文 CAS PubMed MATH Google Scholar

サムナー、LW et al. 化学分析に関する最小報告基準の提案化学分析作業部会 (CAWG) メタボロミクス標準イニシアチブ (MSI)。メタボロミクス 3、211–221 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pang、Z.ら。 MetaboAnalyst 5.0: 生のスペクトルと機能的な洞察の間のギャップを狭めます。核酸研究所 49、W388–W396 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

金久 M. & 後藤 S. KEGG: 京都の遺伝子とゲノムの百科事典。核酸研究所 28、27–30 (2000)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

経路とゲノムの分類学に基づく分析については、Kanehisa, M.、Furumichi, M.、Sato, Y.、Kawashima, M.、Ishigro-Watanabe, M. KEGG が担当。核酸研究所 51、D587–D592 (2023)。

論文 PubMed Google Scholar

金久正人：細胞生物の起源と進化の理解に向けて。タンパク質科学。 28、1947–1951 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mahieu, NG、Huang, X.、Chen, YJ & Patti, GJ 資格証明機能: 非対象メタボロミクス手法のベンチマークと最適化を行うプラットフォーム。アナル。化学。 86、9583–9589 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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シッパーズ、P.、ラシード、S.、パーク、YM 他。ゼブラフィッシュ幼生感染モデルにおける将来の応用のための、非標的メタボローム研究のための抽出方法の評価。 Sci Rep 13、7489 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34593-y

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受信日: 2023 年 2 月 6 日

受理日: 2023 年 5 月 4 日

公開日: 2023 年 5 月 9 日

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