古細菌におけるアンモニアモノオキシゲナーゼの予想外の複雑さ

ISME Journal volume 17、pages 588–599 (2023) この記事を引用する

2820 アクセス

1 引用

28 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この記事の訂正は 2023 年 4 月 28 日に公開されました

この記事は更新されました

アンモニア酸化は硝化の最初のステップとして、地球規模の窒素循環における重要なプロセスを構成します。 しかし、その主要な酵素である銅依存性アンモニアモノオキシゲナーゼに関する基本的な知識は、特に環境中に豊富に存在するアンモニア酸化古細菌（AOA）については不足している。 ここでは、酵素の構造が、ブルーネイティブゲル電気泳動と 2 つの AOA のネイティブ膜複合体からのプロテオミクスによって研究されています。 既知の AmoABC サブユニットと以前に予測されていた AmoX に加えて、2 つの新しいタンパク質サブユニット、AmoY と AmoZ が同定されました。 それらは AOA に特有であり、高度に保存され、共制御されており、それらの遺伝子は、合理化された AOA ゲノム内の他の AMO サブユニット遺伝子とリンクされています。 モデリングおよびゲル内架橋アプローチは、遠縁の細菌微粒子メタンモノオキシゲナーゼと類似した全体的なプロトマー構造を裏付けていますが、この酵素の細胞外ドメインにおける明らかな違いも明らかにしています。 これらのデータは、この生態学的に重要な硝化複合体のさらなる構造機能研究への道を開きます。

硝化、つまりアンモニウムから硝酸塩への変換は、微生物のみによって行われる地球規模の窒素循環における重要なステップです。 このプロセスは、農業および環境との関連性から特に注目を集めています。 硝化の最初の律速段階 [1] は、内在性膜タンパク質複合体アンモニア モノオキシゲナーゼ (AMO) によるアンモニアの酸化です [2、3]。 アンモニア酸化細菌 (AOB) は 125 年以上前に初めて発見され [4]、広く研究されてきましたが、この生物学的プロセスは過去 20 年間に古細菌領域でも検出されました [5、6、7]。 アンモニア酸化古細菌（AOA）は、自然界に広く存在し、ほとんどの陸上および海洋環境で対応する細菌よりも豊富に存在し、窒素循環における重要な役割を示しているため、広く注目を集めています[8,9,10,11,12,13]。 ,14]。 しかし、それらの中心的な窒素および炭素代謝は、AOB のそれとは異なります [15、16、17、18]。 特に、AMO複合体のサブユニットは細菌のサブユニットと約40%の同一性しか示さず[19]、アンモニア酸化の第2段階、すなわちヒドロキシルアミンから亜硝酸塩への変換を触媒する古細菌タンパク質はまだ不明である[19、20、21]。 。 これらの違いは、まだ解明されていない環境上の役割における重要な機能的差異を示唆しています。

硝化生物の増殖の難しさと膜タンパク質の単離に固有の問題により、細菌または古細菌のいずれの AMO 複合体についても構造研究が成功裏に行われたことはありません。 これは、いくつかの注目すべき例外を除いて、CuMMO (銅依存性膜モノオキシゲナーゼ) タンパク質ファミリーのさまざまな酵素のほとんどに当てはまります。 5 つのメタノトローフ生物由来の粒子状メタンモノオキシゲナーゼ (pMMO) の結晶構造 [22、23、24、25、26] およびクライオ EM 構造 [27、28] により、3 つのポリペプチド プロトマー (サブユニット A、B、および -) が一貫して確認されています。 C) 各プロトマーに少なくとも 2 つの保存された金属部位を有するα3β3γ3 立体配置の三量体に配置されています。 それでも、その活性部位の解明は依然として曖昧なままである。 pMMO の PmoB サブユニットに存在すると最初に提案されました [29]。 より最近では、クライオ EM 分析は、主に PmoA によって調整されている活性部位を裏付けています [27]、一方、Verrucomicrobia における異なるアミノ酸保存 [30]、最近の分光学的分析 [31]、および炭化水素モノオキシゲナーゼの突然変異誘発 [32]、 PmoC サブユニットにおけるその局在を示唆しています。

AMO 構造は実験的に決定されていませんが、pMMO をテンプレートとして使用した細菌 Nitrosomonas europaea の AMO の相同性モデリングは、ホモ三量体構造と CuB および CuC 銅部位の保存を裏付けました [33]。 古細菌の AMO 複合体は、すべての CuMMO タンパク質の中で最も縁遠いものであり [34、35]、その構造や機能についてはこれまでのところほとんどわかっていません。 比較メタゲノミクスのみに基づいて、AmoX と呼ばれる追加のサブユニットが複合体中に存在する可能性があることが示唆されています [15、36]。

古細菌の AMO 複合体の全体的な構造についての洞察を得るために、十分に特徴付けられた土壌 AOA、Nitrososphaera viennensis からの膜タンパク質画分を、ネイティブ ゲル電気泳動、質量分析、および化学架橋を使用して生化学的に分析しました。 3 つの既知の AmoABC タンパク質に加えて、さらに 3 つの潜在的なサブユニットが同定され、N. viennensis で予測される 6 つの AmoC タンパク質のうちの 1 つがタンパク質複合体の主要相同体として認識されました。 さらに、AMO 複合体の全体的なサブユニット組成は、遠縁の好熱性 AOA Nitrosocaldus cavascurensis でも確認されました。

Nitrososphaera viennensis は、修飾微量元素溶液 [5]、7.5 μM FeNaEDTA、2 mM NH4Cl、および 1 mM を含む 1.5 L の淡水培地 (FWM) [37, 38] で満たされた 2 L バイオリアクター (Eppendorf) で連続培養として増殖しました。ピルビン酸塩、42 °C、pH 7.5。 炭酸塩は、９８％空気と２％ＣＯ２混合物を反応器にガス供給することによって供給された。 適用した希釈率は 0.035 ～ 0.07 h-1 の範囲でした。

Nitrosocaldus cavascurensis は、N. viennensis について説明したのと同じリアクター、容量、培地でバッチ培養として増殖させましたが、1 mM NH4Cl、1 mM ピルビン酸、および pH 7.0 を使用して 68 °C で培養しました。 炭酸塩もガス供給によって供給されましたが、10% O2 と 2% CO2 の混合物を実現するために空気/N2/CO2 の混合物を使用しました。 バイオマスを増加させるために、培養物を採取する前に、NH4Clをセプタムを介してシリンジで段階的に添加し、最終NO2-濃度を約2.5mMまで増加させた。

収穫されたバイオマスは 3 つの遠心分離ステップで濃縮されました。 まず、最大速度で動作する連続遠心分離機 (CEPA モデル LE) を使用します。 次に、連続遠心分離機からのバイオマスを 400 mL に懸濁し、F12-6 × 500 ローターを備えた Sorvall Lynx 4000 を使用して 4 °C、16,000 × g で 30 分間濃縮しました。 最後に、バイオマスを少量で再懸濁し、1.5 mL エッペンドルフ チューブに等分し、卓上遠心分離機を使用して 4 °C、16,000 × g で 30 分間最終ペレットに濃縮しました。 ペレットはさらなる分析まで-70 °Cで凍結されました。

バイオインフォマティクス分析、膜タンパク質抽出、BN-PAGE 法、トリシン SDS-PAGE 法、質量分析の準備、架橋、データ分析、および AlphaFold 多量体予測の詳細情報は、補足資料と方法で見つけることができます。

簡単に説明すると、細胞を溶解し、膜画分を超遠心分離 (Beckman Coulter Ultracentrifuge; SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor、kmax = 124; 200,000 × g) を使用して 4 °C で 90 分間分離しました。膜タンパク質は、n-ドデシル-β-D-マルトシド (DDM; Invitrogen BN2005) を使用して抽出し、3 ～ 12% プレキャスト BN-PAGE ゲル (Invitrogen BN1001) にロードしました。 選択したバンドを切り出し、質量分析法で分析してタンパク質を同定しました。 タンパク質抽出および BN-PAGE ゲルの実行手順は、以前の研究 [39、40] および Life Technologies の NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System マニュアル (MAN0000557) に基づいていました。 膜抽出および BN-PAGE の研究デザインと分析は、以前の研究に基づいて行われました [41、42]。架橋方法は Hevler らのプロトコールに基づいていました。 （2021年）[43]。

質量分析プロテオミクス データは、N. viennensis の BN-PAGE、N. cavascurensis の BN-PAGE、およびクロスそれぞれリンクされたサンプル。 分析に関連するスクリプトは、GitHub リポジトリ https://github.com/hodgskiss/Archaeal_AMO にあります。

Nitrososphaera viennensis は、生化学分析に十分なバイオマスを得るために、最適な増殖条件下で数週間連続培養で増殖しました (Melcher et al. [45])。 調製物あたり 450 ～ 550 mg のバイオマスから 800 ～ 2000 μg の膜タンパク質が得られ、そのうち約 40 ～ 50 μg がブルーネイティブ PAGE ゲルのレーンにロードされました [39]。 条件の最適化後、22 のバンドが切り出され、質量分析が行われました (補足の材料と方法を参照、図 S1A)。 AMO サブユニット (AmoA、AmoB、および AmoC) は、これらの膜画分全体で検出された最も豊富なタンパク質 (iBAQ 正規化強度の 22%) の 1 つでした。 AmoA、AmoB、および AmoC の相対強度プロファイルは、バンド 4、7、および 12 に対応する 3 つの異なるピークを示し、最も顕著なピークはバンド 7 に発生しました (図 1A)。 iBAQ 正規化強度に基づくと、サブユニット AmoA、AmoB、および AmoC は、バンド 7 に見られる総タンパク質のそれぞれ 10%、5%、および 14% を占めました。 AmoX はバンド 7 にも存在し、10% を占めました。 AmoC サブユニットの最も強いシグナルは、6 つの AmoC ホモログのうち 2 つ、AmoC6 と AmoC4 によって表されました。 これら 2 つの相同体は、BN-PAGE ゲルで同定されたペプチドに基づいて区別できませんでした。 バンド 7 からの切り出しの変性 Tricine-SDS-PAGE では、AMO 複合体のすべての既知の成分が視覚化され、プロテオミクスによって確認されました (図 2)。 さらに、これにより、AmoC6 サブユニットの固有のペプチドの同定が可能になりました (補足説明を参照)。

iBAQ の相対的な存在量は、既知および推定上の AMO サブユニットの強度を正規化しました。 各タンパク質の iBAQ 強度は、そのタンパク質の検出された最高強度に正規化されて、各タンパク質の相対存在量プロファイルが作成されます。 A N. viennensis における AMO 強度のパターン。 B. N. cavascurensis における AMO 強度のパターン。 切断して質量分析法で分析するために選択されたバンドは、左 (ゲルの上部) から右 (ゲルの下部) まで番号付き括弧で示され、それぞれのプロットの X 軸の番号に対応します。 各ゲルのはしごは、それぞれのパネルの下部に表示されます。

BN-PAGE ゲルからの AMO バンドのトリシン-SDS-PAGE。 Tricine-SDS-PAGE ゲルの 3 つの異なる染色法の比較 (左側はサイズ マーカー)。 SimplyBlue SafeStain で染色し、トリプシンを使用して消化したゲルから分析用に切り出したバンドを括弧で示します。 パーセンテージは、個々のバンドごとの iBAQ 正規化タンパク質強度のパーセンテージを表します。 バンド識別子は括弧内に示されています。 A、B、C、および X とマークされた緑色の矢印は、それぞれ AMO サブユニット AmoA、AmoB、AmoC、および AmoX の予想されるバンドの高さを表します。 A、B、C、および X とマークされたオレンジ色の矢印は、それぞれ銀染色ゲルからの AmoA、AmoB、AmoC、および AmoX の同等のバンドを表します。 AmoC 量が最も多いバンドの円グラフは、識別可能な AmoC ホモログに由来する AmoC バンドの割合を示します。

古細菌AMO複合体の一部である可能性のある追加のタンパク質を同定するために、相関分析を実施して、3つの一次AMOサブユニットAmoA、AmoB、およびAmoC4/C6すべてと同様の移動パターンを持つ候補を見つけました。 既知の AMO サブユニットと相関するタンパク質に焦点を当て、Kendall 相関を使用して最も豊富な 50% のタンパク質のパターンを相互に比較し、さまざまなタンパク質間の依存性の可能性を決定しました。 追加の基準は、(i) 完全に配列決定された AOA にそれらが存在すること、および (ii) アンモニアを酸化しない種にそれらが存在しないことである [46]。 これらの基準を最初に満たした 2 つのタンパク質は、推定上の AMO サブユニット AmoX と仮説上のタンパク質 NVIE_004540 でした (表 1)。 これらのタンパク質の移動パターンを図 1A に示します。 この公平な選択プロセスにより追加の AMO 候補が生成されましたが、これらの新たに同定されたサブユニットや他の潜在的なサブユニットの存在を確認するにはさらなる分析が必要でした。

土壌株内の既知のサブユニット、または Nitrososphaeraceae (ゲノム分類データベース [47] によって定義され、全体で使用) 内の既知のサブユニットの以前の分析では、以前に知られていたすべてのサブユニット遺伝子の空間的クラスター化が全体的に欠如していることが示されました。 しかし、ニトロソプミラ科およびニトロソカルダ科内では、標準的な AMO サブユニットである AmoABC および提案されたサブユニット AmoX の遺伝子はシンテニックです [36、48、49]。 潜在的な追加のサブユニット遺伝子の共局在を調査するために、ニトロソカルダ科およびニトロソプミラ科の amo 遺伝子クラスターの上流および下流の 5 つの遺伝子の AOA 全体でのシンテニック状態と保存を分析しました。 これらの遺伝子のうち、19 個は AOA で保存されており、5 個は AOA のみで見つかりました (補足データセット 2)。 対象となる 5 つの遺伝子には、2 つの標準 amo 遺伝子 (amoA および amoB) と遺伝子 amoX、NVIE_004540、および NVIE_004550 が含まれます。 対象遺伝子に amoC が存在しないのは、「Candidatus Nitrosopumilus koreensis AR1」のゲノム内に存在する切断型（おそらくアセンブリの問題による）が原因であり、すべての AOA で保存されていると同定できなかったことが原因と考えられます。 amoX 遺伝子はメタゲノム研究 [15、36] で以前に同定されており、NVIE_004540 はすでに BN-PAGE 相関分析から同定された候補でした。 追加の保存タンパク質 NVIE_004550 が新たに同定され、NVIE_004540 のすぐ上流に位置することが判明し、共転写の可能性を示しています。 2 つの新しい候補は、それぞれ 9.6 kDa と 12.8 kDa のポリペプチドをコードしており、候補サブユニット AmoX と同様に、予測される二次構造は主にらせん構造であり、細胞内局在は膜貫通です。 したがって、2 つの新しい候補 amo 遺伝子 NVIE_004540 および NVIE_004550 は、それぞれ amoY および amoZ と名付けられました。

AOA の進化的再構築における最も初期の分岐系統であるニトロソカルダ科の詳細な分析 [46, 50] により、AMO の 3 つの候補サブユニット (AmoX、NVIE_004540 の AmoY ホモログ、および NVIE_004550 の AmoZ ホモログ) の遺伝子が空間的にクラスター化されていることが明らかになりました。正準サブユニット (AmoABC) を持ち、Nitrosocaldus cavascurensis と Ca ではシンテニックでした。 ニトロソカルドゥス・アイランディカス。 6 つのサブユニット遺伝子すべての空間的クラスター化は、Nitrosocaldus 属内で最近取得された MAG [51] でも見られます。 新しく提案された属 Ca の場合。 Nitrosothermus [51]、amo 遺伝子は複数のコンティグに分割されており、シンテニーを明確に決定することはできませんでした (図 3)。 さらに、6 つの amo 遺伝子はすべて、AOA の最後の共通祖先によって新たに獲得されたものと推測されています [46]。

左: 32 個の保存されたリボソームタンパク質に基づく AOA の系統樹。100% の超高速ブートストラップ値は青い円で示されます。 分類学的ラベルは、GTDB ファミリーのアイデンティティ [47] に従って色分けされており、ニトロソカルダ科 - 赤、ニトロソプミラ科 - 青、ニトロソスファエラ科 - オレンジ色です。 太字のクレード/生物はシンテニック分析に含まれています。 クレードは Alves らに従って命名されています。 （2018年）[34]。 右: AOA のさまざまなクレードにおける一般的なシンテニック パターンの表現。 同じコンティグ上の遺伝子間のギャップはジグザグ線でマークされます。二重スラッシュは別個のコンティグを示します。 ジグザグ線の下の数字は、amo サブユニット遺伝子間の遺伝子の数を表します。 より詳細な分析と種の完全なリストは、それぞれ図S11と補足データセット2にあります。

ニトロソプミラ科の出現は、このゲノム領域が amoABCX を含む一次クラスターと amoYZ を含む二次クラスターに分離されることを伴いました (図 3)。 Nitrosotalea sp. 内では、これらのクラスターは 11 ～ 12 遺伝子離れていますが、他の Nitrosopumilaceae 種では、これらのクラスターは 1 ～ 2 遺伝子しか離れていません (海綿共生生物 Ca. Cenarchaeum symbiosum を除く)。 Nitrososphaeraceae 科の出現により、通常は連鎖している amoA と amoX を除くすべてのサブユニット遺伝子がゲノム全体に散在するようになりました。

amoZ はゲノム解析で同定されましたが、タンパク質 AmoZ (NVIE_004550) は、N. viennensis の BN-PAGE ゲルでは AmoABC と相関しませんでした。 AmoZ の相対存在量プロファイルを調べる場合、AMO ペプチド ピークの一般的なパターンに従いました。 しかし、これは、BN-PAGE ラダーに基づいて約 66 kDa で取得された最後のバンドでピークに達するゲルの底で発生する高い相対存在量ピークのため、相関分析では検出されないままでした (図 1A)。 これは予測質量 12.8 kDa を上回っていますが、AmoZ も AMO の一部である可能性がありますが、結合が弱いと複合体から解離してゲルの底に移動する可能性があることを示唆しています。

N. viennensis の文脈の外で AMO 複合体の組成を試験するために、BN-PAGE アプローチを、最近入手された Nitrosocaldaceae 科の遠縁の好熱性 AOA 種である N. cavascurensis の膜タンパク質画分に適用しました [48]。純粋培養（Melcher et al.準備中）。 わずかに異なるパターンの複合体が得られましたが（図1B）、この好熱性生物では追加のサブユニットの相関がAmoA、AmoB、およびAmoCでも観察されました（N. viennensisで行われたタンパク質のKendall相関）。 3 つのタンパク質 AmoX、NCAV_0488 (AmoY)、および NCAV_0486 (AmoZ) はすべて、AmoABC と強く相関するゲル内での移動パターンを示しました (表 1)。 この分析により、提案されたサブユニットが N. cavascurensis で翻訳され、AMO 複合体内で物理的な接続がある可能性があることが確認されました。

BN-PAGE ゲル内の既知のサブユニットおよび他のタンパク質に対する、提案されたサブユニットの物理的近接性を推定するために、追加の BN-PAGE カットで架橋剤ジスクシンイミジル スルホキシド (DSSO) を使用してゲル内架橋 [43] を実行しました。 -バンド7からの出力（図S1B）。 質量分析および架橋分析により、AmoA、AmoB、AmoC、およびAmoXの間、および新たに提案された2つのサブユニットAmoYおよびAmoZとの間で複数の架橋が示された（図4C）。 多くの架橋は、他の古細菌 (SlaA) から知られているように、おそらく非常に豊富な表面層タンパク質を表す推定上の S 層タンパク質である NVIE_016740 にも接続されていました [52、53]。 このタンパク質はおそらく AOA における偽ペリプラズムの確立に役立つため、それが膜タンパク質に高度に架橋していることが分かるのは驚くべきことではありません。

A、B N. viennensis (A) および N. cavascurensis (B) 六量体の AlphaFold 構造モデルの漫画表示。配列ハイドロパシー解析に基づいた推定の膜配向を示します。 サブユニットは次のように色付けされています: AmoA、ライトグレー。 AmoB、黒。 AmoC、サーモン。 AmoX、ラベンダー。 アモイ、シアン。 AmoZ、青。 CuB および CuC 銅サイトの残基は赤い棒で表されます。 ジスルフィド結合は黄色で示されます。 C N. viennensis の BN-PAGE ゲルから切り出した AMO バンドの既存および提案されている AMO サブユニット間の同定された架橋の表示。 緑色: 比較ゲノミクスに基づくサブユニットの疑い。 青: BN-PAGE 相関とシンテニック分析に基づいて新たに提案されたサブユニット。 D DSSO の溶媒到達可能表面距離 (SASD) 閾値内の架橋 (緑色で示されており、N. viennensis AlphaFold モデルにマッピングされています)。 AmoZ サブユニットと AmoB サブユニットの間に観察された単一の架橋は、SASD 距離基準 (50.0 Å) に違反していますが、ユークリッド距離 (31.8 Å) の範囲内にあるため、マゼンタで示されています。 E Annika と MeroX で特定された固有の DSSO 架橋の SASD およびユークリッド Cα-Cα 距離の分布。 67 個の固有の架橋のうち 27 個が距離基準を満たしました (SASD < 35.0 Å)。 F 架橋サブユニットの組み合わせのパーセンテージ。

AmoX には、他のいくつかのタンパク質への個別の架橋もありました (補足データセット 1)。 単一の結合のみが見つかり、これらのタンパク質は他のシンテニック分析や相関分析では現れなかったため、AMO 複合体の構造的役割を表すものとはみなされませんでした。 これらの架橋は、むしろ細胞膜にこれらのタンパク質が豊富に存在することに起因すると考えられます。

新たに予測されたサブユニットの発現パターンが AMO への関与を裏付けるかどうかを調査するために、AOA の利用可能なトランスクリプトーム研究が検査されました。 N. viennensis における銅の制限に関する最近の研究 [54] では、以前の研究 [55、56、57] でも示されているように、遺伝子 amoA、amoB、および amoC が細胞内で最も高い転写レベルの一部を持っていることが確認されました。 同じデータセットのクラスタリング分析により、amoA、amoB、amoC、amoX、amoY、および amoZ はすべて共制御されているようで、最も高度に発現される遺伝子を含むクラスターに分類されることが明らかになりました。 (図S2;補足データセット2)。 ほとんどの amo 遺伝子について推定上の転写プロモーター配列は同定できますが、6 つの遺伝子すべてについて明らかな保存されたプロモーター モチーフは同定されませんでした。

これらのトランスクリプトームデータの再評価（方法を参照）により、amoC6が主に転写されたamoCホモログであることも明らかになり（図5）、キモトリプシンで消化されたトリシン-SDS-PAGEバンドからの固有のAmoC6ペプチドの同定が確認されました（補足説明） ; 補足データセット 1)。 総合すると、これは、少なくとも適用された増殖条件下では、AmoC6 が N. viennensis の AMO 複合体における一次構造 AmoC ホモログであることを示しています。

Reyes らによる、amo 遺伝子の位置と銅が豊富な条件からの平均 log2 変換転写産物/100 万（TPM）値を示す N. viennensis のゲノム表示。 （2020年）[54]。 ゲノム上のオレンジ色のバーは、強く発現している AMO サブユニット遺伝子の位置を示します。 ゲノム上の青いバーは、転写活性が低い amo 遺伝子を示します。 ボックスは、銅が豊富な培養物からの平均遺伝子発現に基づいて着色された amo 遺伝子 (太字) とそのすぐ隣の遺伝子を示します。 赤は強い発現を示し、青は発現が低いか発現していないことを示します。 強く発現されたすべての amo 遺伝子は、限定された条件と十分な条件の両方で高度に発現された遺伝子のクラスターで見つかりました (図 S2 を参照)。

海洋株 Nitrosopumilus maritimus のトランスクリプトミクスでも、amoA、amoB、amoC、amoX、および amoY の高い発現が示されました (Nmar_1506)。 遺伝子 amoZ (Nmar_1507) は、amoY とシンテニー性がありますが、より低い発現レベルを示しました [55]。

新しく提案された 3 つの AMO サブユニットは、膜タンパク質の回収率を向上させる方法で生成されたプロテオミクス データセットでも検査されました。 既知および提案されている 6 つのサブユニットはすべて、以前の研究 [15] の N. viennensis の膜画分および N. maritimus のプロテオーム [55] で見つかりました。 AOA の他のプロテオミクス研究 [58, 59] では、おそらくサイズが小さく、トリプシン切断部位の数が限られているため、3 つの新しいサブユニットが常に存在するとは限りません。

以前に観察されたように [60]、古細菌の 3 つのサブユニット AmoA、AmoB、および AmoC のアミノ酸配列と細菌のアミノ酸配列を比較すると、古細菌の AMO サブユニットと細菌の AMO サブユニットの主な違いは、膜貫通ヘリックスが欠落していることであることが示されています。 AmoBには少なくとも1つ、AmoCには2つ、そして細菌AmoB/PmoBには欠落したC末端可溶性部分が見られます（図S3〜S5）。 これらの観察は、熱プラズマ門で最近発見された古細菌 AMO の新しいクレードにも当てはまります [61]。 収集された AOA のゲノムに対する細菌ホモログの拡張領域を使用した HMMER 検索では、有意な類似性は明らかになりませんでした。 したがって、Phobius [62] を使用した一般的な構造検索を N. viennensis ゲノムに対して実行し、次の基準でタンパク質をコードできる遺伝子を検索しました：（i）1 ～ 3 回の膜貫通ヘリックス、（ii）すべての AOA にわたる保存[46]、および (iii) 上位 100 の転写遺伝子に存在する [54] (一次 AMO サブユニットと同程度のレベル)。 これにより、6 つの候補が明らかになりました (表 2)。 BN-PAGE でシンテニックおよび類似の移動パターンを維持しながら構造要件を満たす唯一の候補は、amoX、amoY、および amoZ でした。

古細菌に提案されている 3 つのサブユニットを追加すると、膜貫通ヘリックスの数がプロトマーあたり 10 ～ 11 から約 14 に増加し、細菌の pMMO 結晶構造で見られる数に匹敵します。 ）、14〜15の膜貫通ヘリックスを含む[23、63]。

追加で提案された 3 つのサブユニットに照らして古細菌 AMO 複合体の構造的背景についての洞察を得るために、AlphaFold 2.1 の多量体対応バージョンを使用して、N. viennensis AMO 複合体の組織の構造モデルが得られました [64,65] ,66]。 結果として得られたモデルはすべて類似しており、信頼性の高い予測を示していました (最上位モデル、pLDDT = 71.4 および ptm スコア = 0.668)。 AmoX、AmoY、およびAmoZからの予測されたすべての膜貫通ヘリックスは、AmoA、AmoB、およびAmoCからの膜貫通ヘリックスとともに複合体を膜に固定する役割を果たします（図4A）。 さらに、AmoZ の N 末端ドメインには、AmoB の N 末端ドメインと相互作用する 2 つのアルファ ヘリックスが含まれていると予測されており、それによって PmoB に見られる欠落している C 末端可溶性ドメインの役割を置き換え、最後の部分を提供する可能性があります。古細菌には複合体が欠落しています（補足説明の追加情報）。 ジスルフィド結合は、AmoZ の可溶性ドメイン内で形成されることも予測されました。 全体的な構造は、pMMO複合体のプロトマーに匹敵します（図S6）。

AMO複合体の予測される六量体組織の保存度を比較するために、N. cavascurensisのAMO複合体の構造モデルも得られた（図4B）。 結果として得られたモデルは、全体的な配置が互いに、また N. viennensis モデルと類似しており、全体的な信頼度スコアが高かった (最上位モデル、pLDDT = 77.7 および ptm スコア = 0.591)。 N. viennensis モデルと N. cavascurensis モデルの違いには、AmoZ の膜貫通 (TM) ヘリックスの局在が含まれます。 N. viennensis では、TM ヘリックスは主に AmoY の TM ヘリックスと相互作用すると予測されますが、N. cavascurensis では、AmoB および AmoA の TM と相互作用すると予測されます (図 4A、B、S7A、C)。 これは、AmoB 可溶性ドメインに対する AmoZ の N 末端ドメインの相対的な位置に影響を及ぼし、より「開いた」立体構造を可能にします。 ただし、AmoZのヘリックスのN末端ペアとTMドメインを接続する拡張ループにより、理論的にはある程度の柔軟性が可能になります（補足説明、図S8の追加情報）。

N. viennensis での架橋実験からのデータは予測モデルにマッピングされ、いくつかの例外を除いて予測された相互作用を強く裏付けました (図 4D)。 観察された67個のユニークな架橋のうち、27個（40％）が最大溶媒到達可能表面距離（SASD）閾値≤35Åを満たし（図4E）、AmoZを除くすべてのサブユニットの組み合わせが関与していた（図4F）。 AmoZ は 35 Å を超える架橋相互作用のみに関与しており、BN-PAGE の移動パターンで観察されたように、複合体との結合が弱いことを裏付けています。

古細菌の AMO 複合体は、AOA エネルギー代謝の重要な酵素であり、調査されたすべてのアンモニア酸化生物で高度に発現されており、多くの生態系に圧倒的に存在するため、環境に大きな影響を与えています [8,9,10,11,12,13、 14、67]。 ここでの研究は、連続培養におけるAOAの培養における最近の改良（Melcherら、準備中）から恩恵を受けており、提案されたものとは対照的な、ニトロソスファエラ・ウィネンシスおよび他のAOAにおけるAMO複合体の組成に関する新規の生化学的および比較ゲノム証拠を提示している。 AOB 内のこの複合体の組成。

今回の分析では、AmoX、NVIE_004540、および NVIE_004550 がすべて古細菌 AMO 複合体内に存在する可能性が高いことを検証し、NVIE_004540 と NVIE_004550 をそれぞれ AmoY と AmoZ と命名することを提案しています。 この発見は、プロテオミクス、ゲノム、トランスクリプトーム、構造、およびモデリングのアプローチを含む多数の独立した分析に基づいています。 3 つではなく 6 つのサブユニットが存在することは古細菌ドメインに特有であり、古細菌における AMO 複合体のより複雑な制御戦略を表す可能性があります。 アンモニア酸化経路の違いは、古細菌ドメインと細菌ドメインの間ですでに十分に確立されています（すなわち、古細菌の未解決の第 2 ステップ [19, 21]; 細菌の鉄系 c シトクロム [68, 69] およびユビキノン [70, 71] vs . 銅ベースのプラストシアニン [15, 16] および古細菌のメナキノン [72])。 この研究で観察された AMO 複合体内のさまざまな特性は、これらの違いをさらに強調し、AOA と AOB が異なる環境および/または機能的制約の下で硝化に関与しているという一連の証拠を増やしています。

ブルーネイティブ PAGE タンパク質ゲルでは、N. viennensis と Nitrosocaldus cavascurensis の両方の AMO 複合体は、追加のサブユニットを考慮した場合でも、三量体プロトマー複合体の予測高さ (プロトマーあたり 6 つのサブユニットを持つホモ三量体複合体の予測分子量: 296.9 kDa N. viennensis; 305.1 kDa N. cavascurensis)。 古細菌 AMO バンドは、同様に n-ドデシル-β-D-マルトシド (DDM) を使用して抽出されたメチロミラビリス種からの相同細菌 PMO 複合体と比較した場合、ゲル中でより高い分子量でも観察されます [73]。 これは、株の膜組成の違い、またはプロトマーのオリゴマー化の潜在的な違いによって説明される可能性があります。 AOA は、独特のエーテル結合脂質 (すなわち、クレナルカオール) を含み [37、74、75、76、77、78]、擬似ペリプラズム空間を形成するために外膜ではなくタンパク質性 S 層に依存している [52、53]。 。 AMO の 3 つの異なるピークの観察は、AMO が物理的に相互作用している可能性のある他のタンパク質または複合体、特に S 層タンパク質との共移動によって説明できる可能性が最も高くなります。

CuMMO に依存する細菌に関するこれまでの研究では、この複合体に関与すると考えられる他のタンパク質が同定されています。 AOB ニトロソコッカス オセアニ ATCC 19707 からの amoABC を含むモノシストロニック転写物には、amoR および amoD として割り当てられた 2 つの追加遺伝子が含まれていました [79]。 amoR 遺伝子はニトロソコッカス属にのみ存在することが判明しており、したがって細菌の AMO の保存部分であるとは考えられていませんでした。 最近の研究では、AmoD/PmoD (そしておそらく相同な AmoE) が銅の恒常性において重要な役割を果たしていることが示されたが、それらが CuMMO 複合体の構造部分であるとは疑われていない [80]。 むしろ、細菌 PMO の結晶および低温 EM 構造は、PmoA、PmoB、および PmoC の 1 つのサブユニットが各プロトマーを構成する三量体プロトマー構造を一貫して確認しています [22、23、24、25、26、27、28]。

どのサブユニットが CuMMO 錯体の主要な活性部位を保持しているかについては議論があるが、PmoC の金属部位がメタノトローフの錯体において重要な役割を果たしているという明らかな証拠がある [27、28、31、32]。 古細菌のAmoCには、すべての細菌に見られる2つの膜貫通ヘリックスに相当する実質的な部分が欠けていますが（図S5）、初期の結晶構造で観察された金属サイトと、クライオEMによって同定された新しく提案された金属サイト[28]は、すべての古細菌および細菌種にわたって保存されています（図S5）。 このサブユニットの重要性は、相同な炭化水素モノオキシゲナーゼを含む遺伝的に扱いやすい放線菌における部位特異的突然変異誘発研究によっても裏付けられている[32]。

土壌モデル AOA、N. viennensis は、Nitrososphaeraceae 科の他のほとんどの土壌生息 AOA と同様に、amoC 遺伝子の複数の相同体をコードしますが、amoA および amoB の単一コピーのみを保持します [15] (補足データセット 2)。 AMOオペロンから空間的に切り離されたamoCの追加コピーは、一部の陸生AOBによってコードされており、転写研究に基づいてストレス応答に関与していることが示唆されている[81、82]。 Nitrososphaeraceae には、保存された AMO オペロンは存在しません (図 3)。 amoC 遺伝子の重複（他の AMO 遺伝子から空間的に離れている）は、AOA 海洋関連科（ニトロソプミラ科）の一部の種と、AOA 好熱菌（ニトロソカルダ科）の 2 つの MAG にも発生しており、すべて堆積物で発見されている [51、83、84]。 。 amoC の重複は AOA 海綿体共生生物でも見つかり、古細菌 amoC のコピーは海洋ウイルスでも見つかっています [85]。 これらの発見は、アンモニア酸化における生態生理学的適応に対する AmoC サブユニットの代謝的重要性を示す可能性があります。 この研究により、ある特定の AmoC (AmoC6; NVIE_028540) が N. viennensis の複合体内の主要なホモログであることが特定されましたが、他の AmoC サブユニット (の一部) は属レベルでの遺伝子重複によって生じた可能性があります (図 1)。 S9) は、特定の環境条件下で組み込まれ、酵素に異なる活性プロファイルを提供する可能性があります。

比較ゲノミクスを超えて、古細菌について確認された唯一の構造情報は、Candidatus Nitrosocaldus yellowstonensis に由来する異種発現された AmoB の結晶構造に由来しています [86]。 この構造により、C 末端キュプレドキシン ドメインの欠如が確認され、2 つのヘリックスと 2 つのループで構成される細菌には見られない拡張アミノ酸領域が明らかになりました。 C末端ドメインの欠如により支持的相互作用が欠如しているため、この追加領域が既存のキュプレドキシンドメインの安定化に役立つ可能性があることが提案されました。 ただし、このアミノ酸の拡張は、提案されているニトロソカルダス属内でのみ見つかります（図S4）。 すべての AOA 全体で保存されている AmoZ の可溶性ドメインが、この安定化の役割を与えている可能性が高くなります。

追加の構造機能解析が存在しないため、古細菌複合体の追加のサブユニットが、CuMMO ファミリーの他のすべての既知のタンパク質複合体までの膨大な進化的距離を単に反映しているのかどうか [34]、それともこの構造の違いにも関連性があるのか​​どうかは不明です。機能的な意味合い。 例えば、細菌のAMO複合体は、メタンや他の化合物を酸化できる無差別酵素です[87、88、89、90]。 代替基質に関するこのような研究は、古細菌複合体に関してはまだ行われていないが、環境における古細菌（およびおそらくは新しいサブユニット）の機能的役割を評価するために重要であるだろう。 さらに、AOA 種間の AMO 複合体の違いが、AMO 複合体の機能に影響を与える可能性があることが確認されています。 これには、ニトロソカルダス内に見られる追加の AmoB ループが含まれますが、新しく提案されたサブユニット AmoZ によっても明確に示されています。 Nitrososphaera 属と Nitrosocaldaceae 科（両方ともこの研究で調査）は、AmoZ の可溶性ドメインを構成する 2 つのαヘリックスを、保存されていない 2 つのシステインを介してジスルフィド結合を形成すると予測されています（図 S7B、D、S10C）。他のAOA。 さらに、ニトロソコスミカス属は、C末端に4つのシステイン残基で表される追加の亜鉛リボンドメインを含むと予測されており、おそらく細胞質内に存在します（図S10C）。 特定のAOA系統内のジスルフィド結合と亜鉛リボンドメインの観察は、それぞれ活性酸素種に対する感受性と独自の制御戦略に関連している可能性があり、これらの特定のグループの代謝のまだ知られていない側面を補完する独自の進化パターンを反映している可能性があります。

古細菌の種特異的な違いに関係なく、新しいサブユニットを含む全体的な予測古細菌構造は、既知の細菌プロトマー組成を反映しています（図S6）。 これらのサブユニットのオリゴマー化と組織化の決定的な証明は、古細菌 AMO の決定的な構造 (つまり、結晶またはクライオ EM) が実現されるまで不可能です。 メチロコッカス・カプスラトゥス・スト・バスのクライオEM構造（PDB構造7S4H）[28]における推定プロトマー相互作用部位は、古細菌では欠落しているPmoBのセクションにあるようです（図S4）。 ただし、AmoY と AmoZ をプロトマーの外側領域に配置すると、代わりにこれらの相互作用が促進される可能性があります (図 S7)。 分析では単一のプロトマーのみが考慮されているため、これは、AmoY と AmoZ の間の相互作用に違反する SASD が大量にあることも説明できる可能性があります (図 4F)。 これらの相互作用は、異なるプロトマーの AmoY と AmoZ のサブユニット間で行われる可能性があります。 したがって、N. viennensis および N. cavascurensis の予測プロトマー モデルは、三量体古細菌 AMO 複合体の可能性を排除しません。 配向に関しては、現在のモデリング手法では、古細菌 AMO が膜内にどのように位置するかを正確に予測することはできません。 しかし、可溶性AmoBおよびAmoZドメインと同様に活性部位も擬似ペリプラズム空間の方に位置している可能性が高い。 これは、AOA の S 層における栄養輸送の以前のモデリングの取り組み [91]、および AOB およびメタノトローフにおける CuMMO 複合体の活性に基づく免疫金標識 [92] によって裏付けられています。

結論として、この研究は、ゲノム、プロテオーム、およびトランスクリプトームのデータを通じて、AmoX の存在と、古細菌 AMO 複合体内のサブユニットとして AmoY および AmoZ が含まれていることの証拠を提供します。 したがって、古細菌AMOの単一プロトマーは、CuMMOファミリーの他の複合体のように3つのサブユニットではなく、6つのサブユニットで構成されます。 新しいサブユニットの追加により、膜貫通ヘリックスの数は細菌内に見られるCuMMO複合体に匹敵するようになるだろう。 pMMOの膜への固定はその活性にとって重要であることが以前に示されているので[26、28]、新たに同定されたサブユニットが古細菌AMO複合体の構造的および機能的完全性にとって重要な役割を果たしているのはもっともらしいと思われる。 AmoB で欠落している可溶性ドメインの安定化機能を代替できる可溶性ドメインが AmoZ 内に存在することにより、AMO 複合体の潜在的に重要な欠落部分も満たされます。 AmoXYZには重要な構造的役割があると思われるため、古細菌におけるこの環境に関連したタンパク質複合体の将来の発現および構造研究には、すべてのサブユニットを含めることが不可欠である。 事実上すべての生態系における AOA の広範な分布 [8、9、10、11、12、13、14、34] とそれらの生態学的関連性を考慮すると、構造機能を可能にするために AOA のための遺伝的ツールを開発し、そのバイオマス生産を改善することが必要となるでしょう。分析を行い、これらの古細菌におけるアンモニア酸化の完全な経路を解明することを目的としています。

すべてのプロテオミクス データは、PRIDE [44] パートナー リポジトリを介して、N. viennensis の BN-Page、N. cavascurensis の BN-PAGE、および架橋サンプルのそれぞれの識別子 PXD035349、PXD034632、および PXD034475 とともに ProteomeXchange Consortium に寄託されました。 データ分析に関連するスクリプトとコードは、GitHub リポジトリ https://github.com/hodgskiss/Archaeal_AMO にあります。

この論文の訂正が公開されました: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01403-2

ウォン・チョン GM、ローアー RC。 微生物の硝化の動態。 水耐性 1975;9:1099–106。

記事 CAS Google Scholar

ハイマンMR、ウッドPM。 アセチレンによるアンモニアモノオキシゲナーゼの自殺的不活性化と標識。 Biochem J. 1985;227:719–25。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ホロチャー TC、テート ME、ニコラス DJ。 Nitrosomonas europaea によるアンモニアの酸化。 18O トレーサーは、ヒドロキシルアミンの生成にモノオキシゲナーゼが関与していることを示す決定的な証拠です。 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． 1981;256:10834–6。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Winogradsky S. 硝化生物に関する研究。 アン研究所のパトゥール。 1890;4:213–31。

Google スカラー

コネケ M、ベルンハルト AE、デラトーレ JR、ウォーカー CB、ウォーターベリー JB、スタール DA。 独立栄養性のアンモニア酸化海洋古細菌の分離。 自然。 2005;437:543–6。

論文 PubMed Google Scholar

Treusch AH、Leininger S、Kietzin A、Schuster SC、Klenk HP、Schleper C. 亜硝酸レダクターゼおよび Amo 関連タンパク質の新規遺伝子は、窒素循環における未培養の中温性クレンキアエオタの役割を示しています。 環境微生物。 2005;7:1985–95。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヴェンター JC、レミントン K、ハイデルベルク JF、ハルパーン AL、ラッシュ D、アイゼン JA、他サルガッソ海の環境ゲノムショットガン配列決定。 科学。 2004;304:66–74。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Leininger S、Urich T、Schloter M、Schwark L、Qi J、Nicol GW、他。 古細菌は、土壌中のアンモニア酸化原核生物の中で優勢です。 自然。 2006;442:806–9。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ニコル・GW、ライニンガー・S、シュレーパー・C、プロッサー・JI。 アンモニア酸化古細菌および細菌の多様性、存在量および転写活性に対する土壌 pH の影響。 環境微生物。 2008;10:2966–78。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Adair KL、Schwartz E. 米国アリゾナ州北部の半乾燥土壌では、アンモニア酸化古細菌がアンモニア酸化細菌よりも豊富であるという証拠。 マイクロエコル。 2008;56:420–6。

記事 CAS Google Scholar

カーナー MB、デロング EF、カール DM。 太平洋の中深層帯における古細菌の優勢。 自然。 2001;409:507–10。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Shi Y、タイソン GW、エプリー JM、デロング EF。 外洋における層別微生物集団の統合的なメタトランスクリプトームおよびメタゲノム解析。 ISME J. 2011;5:999–1013。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ベイカー BJ、レズニウスキー RA、ディック GJ。 ゲノムを利用したトランスクリプトミクスにより、深海の熱水プルームで硝化を促進する古細菌集団が明らかになりました。 ISME J. 2012;6:2269–79。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ホリボー JT、ギフォード S、シャルマ S、バノ N、モラン MA。 河口細菌プランクトン集団におけるアンモニア酸化生物のメタトランスクリプトーム解析。 ISME J. 2011;5:866–78。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kerou M、Offre P、Valledor L、Abby SS、Melcher M、Nagler M 他。 Nitrososphaera viennensis のプロテオミクスと比較ゲノミクスにより、古細菌のアンモニア酸化剤のコアゲノムと適応が明らかになりました。 Proc Natl Acad Sci USA。 2016;113:E7937–46。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウォーカー CB 、デラトーレ JR 、クロッツ MG 、浦川 H 、ピネル N 、アープ DJ 他 Nitrosopumilus maritimus のゲノムは、世界中に分布する海洋クレンキアにおける硝化と独立栄養の独特のメカニズムを明らかにします。 Proc Natl Acad Sci USA。 2010;107:8818–23。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Berg IA、Kockelkorn D、Buckel W、Fuchs G. 古細菌における 3-ヒドロキシプロピオン酸、4-ヒドロキシ酪酸の独立栄養性二酸化炭素同化経路。 科学。 2007;218:1782–6。

記事 Google Scholar

Könneke M、Schubert DM、Brown PC、Hügler M、Standfest S、Schwander T、他。 アンモニア酸化古細菌は、CO2 固定に最もエネルギー効率の高い好気性経路を使用します。 Proc Natl Acad Sci USA。 2014;111:8239–44。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ランカスター KM、カラント JD、メイジャー SH、スミス MA。 代替バイオエネルギー: 硝化金属酵素学の最新情報と課題。 ジュール。 2018;2:1–21。

記事 Google Scholar

サイモン J、クロッツ MG。 微生物の窒素化合物の変換に関与する生体エネルギーシステムの多様性と進化。 Biochim Biophys Acta - Bioenerg. 2013;1827:114–35。

記事 CAS Google Scholar

コズロフスキー JA、シュティーグルマイヤー M、シュレーパー C、クロッツ MG、スタイン LY。 細菌およびTaumarchaeotaにおける偏性好気性アンモニア依存性化学分解栄養症に必要な経路と重要な中間体。 ISME J. 2016;10:1836–45。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リーバーマンRL、ローゼンツヴァイクAC。 メタンの生物学的酸化を触媒する膜結合金属酵素の結晶構造。 自然。 2005;434:177–82。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ハケミアン AS、コンダパリ KC、テルサー J、ホフマン BM、ステムラー TL、ローゼンツヴァイク AC。 Meticosinus trichosporium OB3b 由来の粒子状メタンモノオキシゲナーゼの金属中心。 生化学。 2008;47:6793–801。

論文 CAS PubMed Google Scholar

スミス SM、ラワット S、テルサー J、ホフマン BM、ステムラー TL、ローゼンツヴァイク AC。 メチロシスティス種 M. Biochemistry 由来の粒子状メタンモノオキシゲナーゼの結晶構造と特性評価。 2011;50:10231–40。

論文 CAS PubMed Google Scholar

シラジュディン S、バルパラ D、ヘリング S、マーカス K、ステムラー TL、ローゼンツヴァイク AC。 粒子状メタンモノオキシゲナーゼの活性と構造に対する亜鉛の影響。 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． 2014;289:21782–94。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Ro SY、Ross MO、Deng YW、Batelu S、Lawton TJ、Hurley JD 他ミセルからバイセルへ: 粒子状メタンモノオキシゲナーゼ活性に対する膜の影響。 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． 2018;293:10457–65。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Chang WH、Lin HH、Tsai IK、Huang SH、Chung SC、Tu IP 他粒子状メタンモノオキシゲナーゼの低温 EM 構造における銅中心は、メタン酸化の触媒機構を明らかにします。 J Am Chem Soc. 2021;143:9922–32。

論文 CAS PubMed Google Scholar

クーCW、トゥッチFJ、ヒーY、ローゼンツヴァイクAC。 脂質二重層における粒子状メタンモノオキシゲナーゼの構造と活性の回復。 科学。 2022;375:1287–91。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バラスブラマニアン R、スミス SM、ラワット S、ヤツニク LA、ステムラー TL、ローゼンツヴァイク AC。 生物学的二銅中心によるメタンの酸化。 自然。 2010;465:115–9。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

オプデンキャンプ HJM、イスラム T、ストット MB、ハルハンギ HR、ハインズ A、ショーテン S 他メタノトローフ性ヴェルコミクロビアに関する環境、ゲノム、分類学の観点。 Environ Microbiol Rep. 2009;1:293–306。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロス MO、マクミラン F、ワン J、ニスタル A、ロートン TJ、オラフソン BD、他。 粒子状メタンモノオキシゲナーゼには、単核銅中心のみが含まれています。 科学。 2019;364:566–70。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リュー EF、トン D、コールマン NV、ホームズ AJ。 炭化水素モノオキシゲナーゼの突然変異誘発は、サブユニット B ではなくサブユニット C の金属中心が銅含有膜モノオキシゲナーゼの活性に必須であることを示しています。 微生物学。 2014;160:1267–77。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Musiani F、Broll V、Evangelisti E、Ciurli S. 銅依存性アンモニアモノオキシゲナーゼのモデル構造。 JBIC J Biol Inorg Chem. 2020;25:995–1007。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Alves RJE、Minh BQ、Urich T、Von Haeseler A、Schleper C. amoA 遺伝子に基づいたアンモニア酸化古細菌の地球規模の系統発生と環境分布の統一。 ナットコミューン。 2018;9:1517。

カドカ R、クロシエ L、ワン L、リム CK、クロッツ MG、ダンフィールド PF。 銅膜モノオキシゲナーゼの進化の歴史。 フロント微生物。 2018;9:2493。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Bartossek R、Spang A、Weidler G、Lanzen A、Schleper C. 土壌グループに属するアンモニア酸化古細菌のメタゲノム解析。 フロント微生物。 2012;3:208。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

デ・ラ・トーレJR、ウォーカーCB、インガルスAE、コネケM、スタールDA。 クレナルケオールを合成する好熱性アンモニア酸化古細菌の培養。 環境微生物。 2008;10:810–8。

論文 PubMed Google Scholar

Tourna M、Stieglmeier M、Spang A、Könneke M、Schintlmeister A、Urich T. Nitrososphaera viennensis、土壌からのアンモニア酸化古細菌。 Proc Natl Acad Sci USA。 2011;108:8420–5。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wittig I、Braun HP、Schägger H. Blue ネイティブのページ。 ナットプロトコル。 2006;1:418–28。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ライジンガー V、アイチャッカー LA。 ブルーネイティブ PAGE 用の膜タンパク質複合体の可溶化。 Jプロテオム。 2008;71:277–83。

記事 CAS Google Scholar

デ・アルメイダ NM、ヴェッセルズ HJCT、デ・グラーフ RM、フェルーシ C、ジェッテン MSM、ケルチェンス JT 他アナモックス細菌の膜結合電子伝達系: コンプレックスソーム解析。 Biochim Biophys Acta - Bioenerg. 2016;1857:1694–704。

記事 Google Scholar

ベルガー S、カブレラ オレフィス A、ジェッテン MSM、ブラント U、ウェルテ CU。 コンプレックスソームプロファイリングによるANME-2dメタン栄養古細菌の中枢エネルギー代謝関連タンパク質複合体の研究。 BBA - バイオエネルギー。 2021;1862:148308。

記事 CAS Google Scholar

ヘブラー JF、ルカッセン MV、カブレラ・オレフィス A、アーノルド S、プロンカー MF、フラン V 他ゲル内架橋質量分析による、同時タンパク質集合体の選択的架橋。 EMBO J. 2021;40:e106174。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ペレス=リベロール Y、チョルダス A、バイ J、ベルナル=リナレス M、ヘワパティラナ S、クンドゥ DJ、他。 2019 年の PRIDE データベースと関連ツールとリソース: 定量化データのサポートの改善。 核酸研究所 2019;47:D442–50。

論文 CAS PubMed Google Scholar

メルチャー M、ホジスキス LH、マルディーニ MA、シュレーパー C、リットマン SMKR。 連続培養で生育した Nitrososphaera viennensis のバイオマス生産性と生理学の分析。 微生物学のフロンティア。 (準備中) 14:206。

アビー SS、ケロウ M、シュレーパー C. 祖先の復元は、穏やかな陸地および海洋環境への放射線照射によるアンモニア酸化古細菌の主要な適応を解読します。 MBio。 2020;11:e02371–20。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rinke C、Chuvochina M、Mussig AJ、Chaumeil PA、Davín AA、Waite DW、他。 ゲノム分類データベース用の標準化された古細菌分類。 ナット微生物。 2021;6:946–59。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アビー SS、メルチャー M、ケロウ M、クルポビッチ M、シュティーグルマイヤー M、ロッセル C 他 Candidatus Nitrosocaldus cavascurensis、アンモニアを酸化する、非常に好熱性の古細菌で、高度に可動性のゲノムを持っています。 フロント微生物。 2018;9:28。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Nicol GW、Schleper C. アンモニアを酸化するクレンカエオタ: 窒素循環の重要な役割? トレンド微生物。 2006;14:207–12。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sheridan PO、Raguideau S、Quince C、Holden J、Zhang L、Gaze WH、他。 遺伝子重複は、Taumarchaeota の主要な系統においてゲノム拡大を促進します。 ナットコミューン。 2020;11:5494。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luo ZH、Narsing Rao MP、Chen H、Hua ZS、Li Q、Hedlund BP、他。 11 月に作成された「Candidatus Nitrosothermus」を含む、メタゲノムで組み立てられた 9 つの新しいゲノムに基づく「Candidatus Nitrosocaldaceae」のゲノム洞察そして「Candidatus Nitrosocaldus」の新種2種。 フロント微生物。 2021;11:608832。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Stieglmeier M、Klingl A、Alves RJE、Rittmann SKMR、Melcher M、Leisch N、他。 Nitrososphaera viennensis gen. 11月、sp. 11 月、土壌からの好気性および中温性のアンモニア酸化古細菌であり、古細菌門 Taumarchaeota のメンバーです。 Int J Syst Evol 微生物。 2014;64:2738–52。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アルバースSV、マイヤーBH。 古細菌の細胞エンベロープ。 Nat Rev 微生物。 2011;9:414–26。

論文 CAS PubMed Google Scholar

レイエス C、ホジスキス LH、ケロウ M、プリバスニヒ T、アビー SS、バイエル B、他銅制限にさらされた際の土壌アンモニア酸化古細菌 Nitrososphaera viennensis のゲノムワイド トランスクリプトーム解析。 ISME J. 2020;14:2659–74。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qin W、Amin SA、Lundeen RA、Heal KR、Martens-Habbena W、Turkarslan S 他。 海洋アンモニア酸化古細菌のストレス反応は、環境個体群の生理学的状態を知らせます。 ISME J. 2017;12:508–19。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

カリーニ P、デュポン CL、サントロ AE。 文化および多様な海洋環境における奇蹟遺伝子発現のパターン。 環境微生物。 2018;20:2112–24。

論文 CAS PubMed Google Scholar

スチュワート FJ、ウロア O、デロング EF。 恒久的な海洋酸素最小ゾーンにおける微生物のメタトランスクリプトミクス。 環境微生物。 2012;14:23–40。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bayer B、Pelikan C、Bittner MJ、Reinthaler T、Könneke M、Herndl GJ、他。 過酸化水素に対する3つの海洋アンモニア酸化古細菌のプロテオミクス応答および従属栄養性アルファプロテオバクテリアとの代謝相互作用。 mシステム。 2019;4:e00181–19。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Santoro AE、Dupont CL、Richter RA、Craig MT、Carini P、McIlvin MR、他外洋のアンモニア酸化古細菌「Candidatus Nitrosopelagicus brevis」のゲノムおよびプロテオーム特性。 Proc Natl Acad Sci USA。 2015;112:1173–8。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

トーラーBB、ハーマンJ、バーガーJR、ファンデンベデムH、若月S、フランシスCA。 アンモニア酸化古細菌の N サイクル酵素の統合された構造生物学と分子生態学。 Environ Microbiol Rep. 2017;9:484–91。

論文 PubMed Google Scholar

ダイアモンド S、ラヴィ A、クリッツ クリストフ A、マテウス カーネヴァリ PB、シャラー A、ウィリアムズ KH、他。 土壌および堆積物は、新規な銅膜モノオキシゲナーゼ (CuMMO) をコードする熱プラズマ古細菌の宿主です。 ISME J. 2022;16:1348–62。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ケル L、クローグ A、ゾンハマー ELL。 膜貫通トポロジーとシグナルペプチドを組み合わせた予測方法。 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． 2004;338:1027–36。

論文 PubMed Google Scholar

ハケミアン AS、ローゼンツヴァイク AC。 メタン酸化の生化学。 Annu Rev Biochem. 2007;76:223–41。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジャンパー J、エヴァンス R、プリッツェル A、グリーン T、フィグルノフ M、ロンネバーガー O、他 AlphaFold による高精度なタンパク質構造予測。 自然。 2021;596:583–9。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヴァラディ M、アニャンゴ S、デシュパンデ M、ナイル S、ナターシア C、ヨルダノバ G、他 AlphaFold タンパク質構造データベース: 高精度モデルによりタンパク質配列空間の構造範囲を大幅に拡大します。 核酸研究所 2022;50:D439–D444。

論文 CAS PubMed Google Scholar

エバンス R、オニール M、プリッツェル A、アントロポバ N、シニア A、グリーン T、他。 AlphaFold-Multimer によるタンパク質複合体の予測。 バイオRxiv。 2022年。https://doi.org/10.1101/2021.10.04.463034。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

クロッツMG、スタインLY。 硝化因子のゲノミクスと窒素サイクルの進化。 FEMS 微生物レター。 2008;278:146–56。

論文 CAS PubMed Google Scholar

山中 T、新羅 M. Nitrosomonas europaea 由来のシトクロム c-552 およびシトクロム c-554。 Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． 1974;75:1265–73。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Arciero DM、Hooper AB、Balny C. Nitrosomonas europaea 由来のヒドロキシルアミン酸化還元酵素によるチトクロム c554 の還元の分光学的および迅速速度論的研究。 生化学。 1991;30:11466–72。

論文 CAS PubMed Google Scholar

フーパー AB、エリクソン RH、テリー KR。 ニトロソモナスの電子伝達系: 膜エンベロープ画分の単離。 J バクテリオール。 1972;110:430–8。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィテカー M、バーグマン D、アルシエロ D、フーパー AB。 化学合成栄養細菌 Nitrosomonas europaea によるアンモニアの酸化中の電子移動。 Biochim Biophys Acta - Bioenerg. 2000;1459:346–55。

記事 CAS Google Scholar

Elling FJ、Becker KW、Könneke M、Schröder JM、Kellermann MY、Thomm M 他。 古細菌の呼吸器キノン：系統分布と海洋環境におけるバイオマーカーとしての応用。 環境微生物。 2016;18:692–707。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヴァーサントフォールト W、ゲレーロ・カスティージョ S、ウェッセルズ HJCT、ファン ニフトリック L、ジェッテン MSM、ブラント U 他亜硝酸塩依存性メタノトローフ、メチロミラビリス ランタニド生物の複合体解析。 Biochem Biophys Acta - Bioenerg. 2019;1860:734–44。

論文 CAS PubMed Google Scholar

投手 A、リクリク N、ホップマンズ EC、スピース E、リップストラ WIC、オセバール J、他クレナルケオールは、好熱性グループ I.1b 古細菌である Candidatus Nitrososphaera gargensis の膜脂質を支配しています。 ISME J. 2010;4:542–52。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Villanueva L、Damsté JSS、Schoouten S. 古細菌の膜脂質生合成経路の再評価。 Nat Rev 微生物。 2014;12:438–48。

論文 CAS PubMed Google Scholar

シニンハ・ダムステJS、スハウテンS、ホップマンズEC、ヴァン・ドゥインACT、ジーネヴァセンJAJ。 クレナーケオール: 国際的な遠洋性クレナーケオータの特徴的なコア グリセロール ジビフィタニル グリセロール テトラエーテル膜脂質。 J脂質分析。 2002;43:1641–51。

記事 Google Scholar

Sinninghe Damsté JS、Rijpstra WIC、Hopmans EC、Jung MY、Kim JG、Rhee SK、他土壌中のグループ I.1a および I.1b の無傷の極性およびコアグリセロール ジビフィタニル グリセロール テトラエーテル脂質。 アプリケーションエンビロン微生物。 2012;78:6866–74。

論文 PubMed Central Google Scholar

Elling FJ、Könneke M、Mußmann M、Greve A、Hinrichs KU。 海洋浮遊性奇蹟菌分離株の膜脂質組成およびTEX86に対する温度、pH、および塩分濃度の影響。 ジオチム・コスモチム・アクタ。 2015;171:238–55。

記事 CAS Google Scholar

エル・シェイクAF、ポレット・ピーターソンAT、クロッツMG。 海洋アンモニア酸化剤ニトロソコッカス オセアニ ATCC 19707 の amo オペロンにおける 2 つの新しい遺伝子、amoR および amoD の特性評価。Appl Environ Microbiol。 2008;74:312–8。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Fisher OS、Kenney GE、Ross MO、Ro SY、Lemma BE、Batelu S、他。 メタンおよびアンモニア酸化細菌から得られる、長らく見過ごされてきた銅タンパク質の特性評価。 ナットコミューン。 2018;9:4276。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ベルベ PM、サムドララ R、スタール DA。 すべての amoC コピーの転写は、アンモニア飢餓からの Nitrosomonas europaea の回復に関連しています。 J バクテリオール。 2007;189:3935–44。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ベルベ PM、スタール DA。 アンモニアモノオキシゲナーゼの分岐型 AmoC3 サブユニットは、Nitrosomonas europaea のストレス応答システムの一部として機能します。 J バクテリオール。 2012;194:3448–56。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lebedeva EV、Hatzenpichler R、Pelletier E、Schuster N、Hauzmayer S、Bulaev A、他。 グループ I.1a アンモニア酸化古細菌「Ca」の濃縮とゲノム配列 Nitrosotenuis uzonensis は、温熱生息地に世界的に分布するクレードを代表します。 PLoS ワン。 2013;8:e80835。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Qin W、Heal KR、Ramdasi R、Kobelt JN、Martens-Habbena W、Bertagnolli AD、他 Nitrosopumilus maritimus gen. 11月、sp. 11 月、ニトロソプミルス コバラミニゲネス sp. 11 月、Nitrosopumilus oxyclinae sp. １１月、およびＮｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ ｕｒｅｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐ． 11月、Thaumarchaeota門の4つの海洋アンモニア酸化古細菌。 Int J Syst Evol 微生物。 2017;67:5067–79。

論文 PubMed Google Scholar

アールグレン NA、フックスマン カリフォルニア、ロキャップ G、ファーマン JA。 amoC 硝化遺伝子をコードする、新規で広範囲に存在し、生態学的に異なる海洋性タウマルカエオタ ウイルスをいくつか発見。 ISME J. 2019;13:618–31。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロートン TJ、ハム J、サン T、ローゼンツヴァイク AC。 アンモニアモノオキシゲナーゼ/粒子状メタンモノオキシゲナーゼスーパーファミリーにおけるBサブユニットの構造保存。 タンパク質。 2014;82:2263–7。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ハイマンMR、ウッドPM。 Nitrosomonas europaea によるメタン酸化。 Biochem J. 1983;212:31–37。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ハイマンMR、ウッドPM。 Nitrosomonas europaea によるエチレンの酸化。 アーチ微生物。 1984;137:155–8。

記事 CAS Google Scholar

ハイマンMR、マートンIB、アープDJ。 Nitrosomonas europaea 由来のアンモニア モノオキシゲナーゼとアルカン、アルケン、およびアルキンとの相互作用。 アプリケーションエンビロン微生物。 1988;54:3187–90。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジョーンズRD、森田RY。 Nitrosococcus Oceanus および Nitrosomonas europaea によるメタン酸化。 アプリケーションエンビロン微生物。 1983;45:401–10。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li P、ハーマン J、Tolar BB、Poitevin F、Ramdasi R、Bargar JR 他栄養素の輸送は、荷電古細菌表層タンパク質の進化的基盤を示唆しています。 ISME J. 2018;12:2389–402。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

サコウラ D、スミス GJ、フランク J、メスマン RJ、コップ LFM、ブロム P、他アンモニアおよびアルカン酸化細菌に対する普遍的な活性ベースの標識方法。 ISME J. 2022;16:958–71。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

N. viennensis の栽培において優れた技術支援をしていただいた Anas Mohammed Mardini 氏と、プロジェクトの初期議論において貴重なご意見をいただいた Wolfram Weckwerth 氏に感謝いたします。 また、細胞溶解のための OneShot マシンの技術的支援と使用については Florian Sikora と Boris Görke 博士、超遠心分離機の支援と使用については Stephanie Aichorst 博士に感謝します。 また、ウィーン大学のライフ サイエンス コンピューター クラスター (LiSC) のメンテナンスとアクセスを提供してくださった計算システム生物学部門 (CUBE) のトーマス ラッテイ博士、フロリアン ゴールデンバーグ氏、ヨハン ドーン氏にも感謝します。

このプロジェクトは、Doktoratskolleg (DK) に加え、微生物窒素循環—単細胞から生態系まで (オーストリア科学基金 W1257)、ERC Advanced Grant TACKLE (No. 695192)、および欧州連合の Horizo​​n 2021 ～ 2027 研究革新プログラムによって支援されました。助成契約番号 101079299。

ウィーン大学、機能進化生態学部、古細菌生物学およびエコゲノミクスユニット、ウィーン、オーストリア

ローガン・H・ホジスキス、マイケル・メルチャー、メリーナ・ケロウ、ラファエル・I・ポンセ＝トレド、クリスタ・シュレーパー

質量分析施設、マックス ペルツ研究所、ウィーン バイオセンター (VBC)、ウィーン、オーストリア

チェン・ウェイチャン & マルクス・ハートル

VIB 炎症センターおよび生化学・微生物学部、ゲント大学、ゲント、ベルギー

サバス・N・サヴィデス

ウィーン大学、機能進化生態学部、分子システム生物学ユニット、ウィーン、オーストリア

ステファニー・ウィーンコープ

生化学および細胞生物学部、マックス・ペルツ研究室、ウィーン大学、ウィーン、オーストリア

マルクス・ハートル

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

LHH、MK、SW、MH、CS が研究プロジェクトを概念化しました。 調査はLHH、MK、WC、SNS、RIPTによって実施されました。 バイオマス生産はMMによって行われました。 LHH、MK、CS がこの論文を執筆し、MM、WC、RIPT、SNS、SW、MH からの編集と寄稿が行われました。

クリスタ・シュレーパーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

この記事の元のオンライン版は改訂されました。この記事では、Savvas N. Savvides の所属の詳細が誤って記載されていました。 「VIB Center for Inflammation Center andDepartment of Biochemistry & Microbiology, Ghent University, Ghent, Belgium」だったはずです。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

ホジスキス、LH、メルチャー、M、ケロウ、M 他古細菌におけるアンモニアモノオキシゲナーゼの予想外の複雑さ。 ISME J 17、588–599 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41396-023-01367-3

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 7 月 8 日

改訂日: 2023 年 1 月 9 日

受理日: 2023 年 1 月 12 日

発行日: 2023 年 1 月 31 日

発行日：2023年4月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01367-3

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

ISME ジャーナル (2023)