ライト

Communications Biology volume 6、記事番号: 502 (2023) この記事を引用

4854 アクセス

39 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ライトシート蛍光顕微鏡は、生物学的プロセスを迅速かつ長期間にわたって視覚化し定量的に測定する能力を変革しました。このレビューでは、その機能がさらに拡張されると予想されるライトシート蛍光顕微鏡の現在および将来の開発について説明します。これには、従来のイメージングのトレードオフ、つまり時空間解像度、視野、サンプルの状態を克服するためのスマートで適応的なイメージングスキームが含まれます。スマート顕微鏡では、顕微鏡が、いつ、どこで、何を、どのように画像化するかを自律的に決定します。さらに、画像修復技術がこれらのトレードオフを克服する手段をどのように提供するか、および「オープントップ」ライトシート顕微鏡がどのようにして高スループットのマルチモーダルイメージングを可能にするかを評価します。そのため、ライトシート顕微鏡法は将来、生物医学および臨床イメージングにおいて重要な役割を果たすと予測しています。

過去数十年にわたり、顕微鏡は生物学的プロセスが空間と時間の中でどのように組織されるかについて貴重な洞察を私たちに提供してきました。核となる革新は、蛍光マーカーによるタンパク質と脂質の選択的標識1,2であり、これにより、ライトシート蛍光顕微鏡（略してライトシート顕微鏡）3などの蛍光顕微鏡技術が可能になります。ライトシート顕微鏡により、生体内 4,5,6 および試験管内 7,8,9 で構造成分を視覚化し、定量化し、動的に追跡することができます。ライトシート顕微鏡の基礎については、いくつかのレビュー10、11、12、13、14、15、16、17、18、19でカバーされていますが、要するに、照明と検出経路の直交分離に依存しており、選択的な選択を可能にします。画像面全体の照明と同時の広視野検出（図 1a）。

a 3 対物レンズ選択的平面照明顕微鏡 (SPIM) などの従来のライトシート顕微鏡は、照明 (青、照明対物レンズ IL1 および IL2) と検出 (緑、検出対物レンズ DO) の直交配置に依存しています。これにより、イメージングの軸方向の解像度が主にライトシート (青) の厚さによって左右されることが保証され、広視野検出 (緑) と良好な光学的セクショニングによる大きなサンプル全体のイメージングが可能になります。 3D ボリュームを取得するには、サンプル自体を移動するか、検出経路内の対物レンズと一緒にライトシートを走査することにより、サンプルを検出軸に沿って走査します。 b–d ライトシートを使用したイメージングの主な例には、マウスやゼブラフィッシュの胚の発生過程の連続的かつ長期的なイメージングや、細胞以下の解像度での透明な組織のイメージングなどがあります。 b Katie McDole et al.4 は、CAGTAG1 発現マウス胚をヒストンマーカー (H2B-eGFP) で 44 歳以上画像化することにより、初期線条 (E6.5) から体節段階 (E8.5) までのマウスの発生に関与する細胞の動きを特徴付けました。 h. スケールバー: 100 μm。 c 蛍光血管マーカー（Tg（kdrl:EGFP）、シアン）および赤血球マーカー（Tg（GATA1a:dsRed）、マゼンタ）で標識された成長中のゼブラフィッシュ血管構造のマルチビューイメージング5（3つの角度）から選択された投影図。、受精後 20 時間 (hpf) から 86 hpf までの画像。スケールバー: 500 μm d Adam Glaser ら 37 は、サイズ 3.2 cm × 2.1 cm、厚さ 1 mm の腎臓の拡大スライスの大規模イメージングを実行しました。高解像度の関心領域により、糸球体 (スケールバー: 40 μm)、血管 (スケールバー: 80 μm)、および尿細管 (スケールバー: 50 μm) の形態が明らかになりました。拡大による解像度の向上は、DAPI 対比染色組織のマルチチャンネルズームインでさらに実証されました (スケールバー: 100 μm [上] および 20 μm [下])。したがって、スケールバーは、自然の非拡張組織の寸法を示します。パネル b は、Katie McDole らの許可を得て改変されました。（2018年）4．パネル c は Daetwyler らから改変されました。（2019年）5．パネル d は Glaser らから改変されました。（2019）37．

このレビューでは、ライトシートを使用した蛍光イメージングの将来の可能性について展望し、議論します。体積的および時間的なイメージング障壁が、高い時空間分解能で大きな標本を捕捉するための光学顕微鏡の応用をどのように制限するかについて説明し、それらを克服する戦略を探ります。これには、技術の進歩、新しいスマートで適応性のあるイメージングスキーム、画像復元技術が含まれます。さらに、このようなスキームが柔軟なオープントップライトシート顕微鏡とどのように連携して、高スループットのマルチモダリティイメージングを可能にするかを検討します。

ライトシート顕微鏡は、その効率的かつ穏やかな 3D イメージング能力で際立っています。これは、顕微鏡検出システムの焦点面を照明するシート状の光強度分布によって特徴付けられます (図 1a)3,16。これには多くの利点があります。最も重要なことは、検出システムの焦点面のみ (または少なくとも大部分) が照明されるため、光学的セクショニングが発生し、焦点外の励起が最小限に抑えられることです 15、16、19。これにより、広視野や共焦点などの従来の落射蛍光顕微鏡技術と比較して、ぼやけのない鮮明な画像が得られ、サンプルの漂白が大幅に減少します10,20。

焦点面の励起は伝統的に、ライトシートを起動するための 1 つまたは 2 つの照明対物レンズを使用して実現されます 3,21。これにより、コヒーレントレーザー光はガウシアン 3、トップハット 21、単一または複数のベッセル 22、23、エアリー 24、またはその他 25、26 ビームに整形され、有限距離にわたるシートに近似する強度分布をサンプル内に作成します。体積イメージングは、サンプルをスキャンする 3、焦点深度を増やす 27、またはシートと検出器を移動する 28、29 のいずれかによって実現されます。

励起された蛍光色素分子の検出は、科学用カメラの広視野検出で照射面の蛍光シグナルを捕捉することによって実現されます16。ライトシート顕微鏡の利点を理解するには、空間デューティサイクルの概念が重要です。これは、曝露中に蛍光色素がどれくらいの時間オンになっているかを表します。ライトシート顕微鏡では面全体が照明されるため、一度に体積の一部のみがスキャンされる従来の点走査型共焦点顕微鏡と比較して、空間デューティサイクルがはるかに高くなります。その結果、より低いレーザー出力を適用して同様の信号を生成することができます。多くの光退色効果や光毒性効果は励起強度に対して非常に非線形であるため、これは重要です10,20。ただし、散乱により組織のより深い部分のイメージングが妨げられるため、広視野検出ではライトシート顕微鏡の光学的侵入深さが制限されます。それにもかかわらず、小さなオルガノイドやモデル生物の場合、特にサンプルの異なる方向からの情報を組み合わせる画像融合 30 と組み合わせる場合、ライトシート顕微鏡法を適用できます。これにより、散乱によって遮られてしまうエリアを、最も好ましい視野角から訪問できるようになります15、31、32。サンプルの回転によって複数のビューを取得できます。また、最近の実装では、最大 4 つの対物レンズがライトシート照明と検出を交互に行うための光路を提供します 33、34、35。

これらの機能により、ライトシート顕微鏡は、サンプルごとに数百から数千のスタックにわたって 3D データを穏やかに取得できるようになりました。得られたデータにより、細胞内シグナル伝達や形態 23,25、数日間にわたる胚形成 4,5,36 (図 1b,c) などの動的なプロセスの定量化が明らかになり、定量化が可能になり、細胞内分解能で大きな透明組織を迅速に取得できるようになりました 37,38,39。、40（図1d）。

ライトシートやその他の蛍光顕微鏡 16 によって提供される高速かつ穏やかな体積イメージングにもかかわらず、これらは最終的には体積および時間イメージングの障壁によって制約されます (図 2)。前者は大きな標本を高解像度で画像化できないことを指しますが、後者は非常に高速なプロセスを長期間にわたって継続的に画像化できないことを指します。

a ライトシート、共焦点、超解像顕微鏡などの現在のイメージング技術は、技術的および実際的な制限により、イメージングできる体積が限られています (青色のグラデーション: 低空間解像度から高空間解像度へ。白い破線の円は、主な応用領域を示しています)。 3 つの顕微鏡技術)。この体積イメージングの障壁を克服するために、拡大顕微鏡法により、低解像度のイメージング技術を効果的に高い解像度で取得できるようになります。さらに、新しい適応型スマートイメージング技術と多重解像度イメージングが、大容量の一部を高解像度で選択的にイメージングすることにより、ボリュームイメージングの障壁を克服できると期待しています。さらに、圧縮センシングや深層学習アプローチなどの画像再構成アルゴリズムは、部分的にサンプリングされた大量の画像から高解像度の画像を取得する手段を提供します。さらに、適応的でスマートなイメージングスキームが、高速画像化に対する時間的イメージングの障壁を克服すると期待しています。長期間にわたって選択的に処理します。

体積イメージングバリア (図 2a) は、特定のイメージング技術の最大体積到達距離によって与えられます。たとえば、マウス全体などの大きな標本は、現在、共焦点イメージングや超解像度イメージングでその全体をイメージングすることはできません。これは、光散乱による光透過などの物理的制限や、開口数と作動距離および視野とのトレードオフなどの光学工学によって部分的に支配されます41。

さらに、適切なナイキストサンプリングがレート制限になる可能性があるため、大きな標本を高解像度でイメージングすることは現実的ではありません。これを説明すると、解像度 250 nm の従来のレーザー走査型共焦点顕微鏡の一般的なボクセル滞在時間は約 1 μs42 であるため、2048 × 2048 × 1 の共焦点画像をキャプチャするには約 4.2 秒かかります。 Airyscan 顕微鏡で解像度を 2 倍の 120 nm43 にするには、同じ視野を得るのに約 16.8 秒かかります。したがって、ナイキストサンプリングを備えた共焦点顕微鏡を使用してサイズ 9 × 10−3 mm3 (幅 0.18 mm、長さ 0.51 mm) のショウジョウバエの卵 44 を画像化するには 76 分かかり、Airyscan 共焦点では 10 時間以上かかります。これにより、1分以内に起こるエンドサイトーシスプロセスなどの細胞動態の研究を可能にする速度でのイメージングが妨げられます45。ライトシート顕微鏡は、広視野の取得と高いデューティサイクルによりはるかに高速ですが、格子ライトシート顕微鏡23,46や軸方向掃引ライトシート顕微鏡(ASLM)47などの高解像度バージョンでは、依然として大量の取得に苦労する可能性があります。十分に速い。

同様に、時間的なイメージングバリアがあります（図2b）。現在のところ、生成されるデータの量、サンプルの健全性および蛍光色素分子の漂白への影響により、迅速なプロセスを長期間にわたって画像化することはできません。たとえば、1 日にわたって 1 ミリ秒ごとに 2048 × 2048 × 1 ボクセルの画像を撮影すると、約 700 TB のデータセットになります。将来的には、新しいハードウェアと大規模なストレージによりデータの問題が解決される可能性がありますが、連続イメージングは光毒性効果を誘発し、イメージングサイクルにわたって蓄積されます 20,48。

その結果、ナイキストサンプリングによって管理される従来の収集は、サンプルの健全性、時間分解能、空間分解能、視野または体積測定範囲のそれぞれの間のトレードオフによって制限されます（図3a）。これらのトレードオフを考慮するために、顕微鏡医は目前の生物学的疑問に最もよく適合するイメージングモダリティを 1 つ選択し、選択した設定で最後まで実験を実行する必要があります (図 3b)。

伝統的に、取得はサンプルの限られたフォトンバジェットによって管理されます。したがって、空間的および時間的解像度の向上は、通常、サンプルの状態と画像化される視野に悪影響を及ぼします。したがって、ピラミッドの 1 つのコーナーを最適化すると、他のコーナーに対するトレードオフが発生します。 b したがって、従来の収集では、尋ねられる生物学的質問によって定義されるイメージングのニーズを最もよく反映するように、1 つの顕微鏡および/または 1 つの顕微鏡設定が選択されます。たとえば、非蛍光収集 (明視野イメージング) による最高のサンプルの状態、最高の空間分解能などです。、例えば、分子シグナル伝達の研究用 (青色の構成要素)、生物体全体または脳全体などの器官を捕捉するための最大の視野 (オレンジ色の構成要素)、または神経信号伝達や生物体の動きなどの高速プロセスを捕捉するための最高の時間分解能(黄色の積み木)。 c 将来的には、新しいスマートで適応性のあるイメージングスキームが 1 回の実験内でモジュール式イメージングを提供することで現在の制限を克服すると予想されます。これにより、顕微鏡はイベントベースの検出を使用してイメージングモードを自動的に切り替えることができるようになり、たとえば、広い視野 (オレンジ色の構成要素)、空間的 (青色の構成要素) および時間的 (黄色の構成要素) の解像度が最適化されます。サンプルの健康状態 (緑色の構成要素)。このような新しい画像化スキームの最近の実装では、Mahecic et al.96 がイベントベースの検出にニューラルネットワークを利用しました。ここでは、取得した入力画像を取得し、顕微鏡を誘導するためのイベントベースの確率マップを出力する、利用される U-Net ネットワークのアーキテクチャが表示されます。 U-Net は、エンコーダー (ダウンサンプリング層、青)、デコーダー (アップサンプリング、緑) セクション、および層間の接続 (ベージュ) で構成されます。

体積イメージングの障壁を押し上げるために、多光子励起 49,50,51、波面整形 52、組織除去 53、および拡大顕微鏡法 54,55 が開発され、光散乱および吸収プロセスによるイメージングの物理的限界を克服しました。物理的な散乱と吸収は、血液、メラニン、水、色素などの組織固有の吸収性発色団と、細胞や組織の構造内の小規模および大規模な散乱体によって発生します56、57。この結果、組織への光学顕微鏡の浸透が減少し、イメージングが組織表面から数十から数百マイクロメートルに制限されます58（つまり、1つの光学平均自由行程）。

多光子励起 49,50,51 により、一部の組織では光の侵入深さが 1 mm 以上増加しました 49,59。ただし重要なのは、ライトシート顕微鏡法は、ラスタースキャン技術ほど多光子励起の恩恵を受けられないことです。これは、ライトシート顕微鏡では広視野画像を形成する必要があり、それが可視波長の光散乱によって厳しく制限されるためです。対照的に、多光子ラスター走査型顕微鏡は、戻ってくる蛍光光子で鮮明な画像を形成する必要がないため、より深くまで到達できます。したがって、生体内ライトシート顕微鏡法は現在、ほとんどの組織で深さ 100 ミクロン未満に制限されています。

代わりに、色素沈着のないゼブラフィッシュ系統などの適度に半透明なモデル生物を賢明に選択することにより、in situ および in vivo でのライトシートイメージングが可能になりました。さらに、浸漬媒体の屈折率をサンプルに合わせて調整すると 61、62、散乱が減少し、浸透深さが向上します。また、近赤外 II 窓 (900 ～ 1700 nm) の蛍光プローブへの移行により、組織内でのライトシート顕微鏡の到達範囲が拡大する可能性が示されています 63。波長が長いほど本質的に散乱平均自由行程が長くなり、生体組織の吸収窓と重なる可能性があります64。しかし、この光学窓用のプローブの開発は、より長い波長での吸収と放出には電子共役の増加が必要であり、多くの場合、分子剛性の低下、非放射減衰源の増加、および低い量子収率を伴うため、依然として困難なままである65,66。量子ドット67とカーボンナノチューブ68は、蛍光タンパク質/色素分子の代替として使用されていますが、標識の特異性と生体適合性が複雑になります。したがって、近赤外ライトシートイメージングの将来は、プローブ開発における将来のブレークスルーに大きく依存します。

さらに、波面補正スキーム、特に多重共役補償光学 (MCAO)69,70 の進歩により、光の侵入深さがさらに増加する可能性があります。 MCAO は、従来の補償光学では狭い領域、いわゆるアイソプラナティックパッチしか補正できないという問題に取り組んでいます 71,72。組織では、このパッチはカメラの視野よりも小さくなる可能性があり、ライトシート顕微鏡の並列検出の利点が無効になります。組織の異なる領域を個別に補正することにより、MCAO はアイソプラナティックパッチサイズを拡大する可能性があり 69,70 、組織内の効果的なライトシートイメージングを可能にする可能性があります。ライトシート顕微鏡用の従来の補償光学は実証されている 73,74 が、そのセットアップは非常に複雑であることが特徴でした。空間的に変化する収差を迅速に補正するために、ライトシート顕微鏡の励起経路と発光経路の両方に専用の波面センサーと可変ミラーが採用されました。そのため、MCAO にさらに多くのコンポーネントを追加し、そのようなシステムを過度に複雑にすることは、最初は突飛なことのように思えるかもしれません。しかし、機械学習を通じて、専用の波面センサーを使用せずに収差を感知できるようになり、装置の制約が大幅に緩和されると私たちは考えています。さらに、可変ミラーの代わりに、透過型可変波長板が波面補正に有望であることが示されている77。原理的には、このようなデバイスを顕微鏡の画像空間に積み重ねて MCAO を実行することも、専用の統合 3D 波面整形デバイスを考案することもできます。

固定組織の場合、組織の除去によるサンプル前処理 53 により、光散乱に伴う深さの制限を大幅に克服できます。この文脈で特に興味深いのは、サンプルを物理的に 10 倍以上に拡大できる拡大顕微鏡 54,55 です 78,79 (図 1d)。これにより、あらゆる顕微鏡の分解能が拡大率によって効果的に向上し、ライトシート顕微鏡がこれまで超解像顕微鏡に限定されていた分解能レベルに到達できるようになります（図2a）。したがって、拡大顕微鏡法はサンプルを変更することで体積イメージングの障壁を克服する方法ですが、拡大プロセスでは常に超微細構造が保存されるとは限らず、慎重な検証が必要であることに注意してください。現在の課題は、何千倍も大きな体積を効果的に画像化することであり、これにより、最も効率的な体積測定ライトシート顕微鏡のテストも行われることになります。拡大顕微鏡法が進歩するにつれて、より大きな視野、より大きなカメラ、作動距離を備えた新しいライトシート顕微鏡を設計する必要性がさらに高まっています。また、この探求では、ライトシートを迅速にタイル81、82、またはスキャン39して広い視野をカバーする技術がさらに必要になる可能性があります。

ライトシート顕微鏡 3 や拡大顕微鏡 54,55 のように、新たな開発によってイメージングの障壁を打ち破ることは可能ですが、補完的なアプローチは、さまざまな技術の長所をモジュール式に組み合わせて 1 つのイメージングワークフローにすることです (図 3c)。これにより、顕微鏡システムは、時空間サンプリング、視野、サンプル照射などのモジュールをいつどのように適用するかを自動的に決定します。したがって、このようなスマートで適応的なイメージングスキームが従来のナイキストサンプリングを克服し、ライトシート顕微鏡を含む光学顕微鏡の機能を拡張すると私たちは想像しています。

このような普遍的なスマートで適応性のあるスキームに向けた最初のステップはすでに達成されています。スマートで適応性のあるイメージングスキームに対する新たな要件は、変化を監視するための取得データのリアルタイムのオンザフライ処理に基づくフィードバックループです。

顕微鏡画像のリアルタイム解析は、1 つのイメージングモダリティ内のイメージングパラメーターを改善するために確立されています。画期的な論文の中で、McDole et al.4 は適応型ライトシート顕微鏡法を適用し、リアルタイムの標本追跡と全体のイメージングボリュームおよびその他の顕微鏡パラメータの自動調整によってマウスの胚の発生を捕捉しました (図 1b)。これにより、イメージングスキームはドリフト、成長、および光学特性の変化を補償し、ほぼ一定のサイズと形状を必要とした以前に公開された自動顕微鏡検査ルーチン AutoPilot83 を改善します。ライトシートベースの技術の重要なパラメータは、イメージングボリュームと、相対的なオフセットと角度を含むライトシートと検出焦点面の間の空間的重なりの最適化です4,83]。当社の見解では、従来の顕微鏡との主な違いは、照明と検出が分離されていることであるため、最高の結像性能を得るにはこの相対的な位置合わせが重要です。さらに、SPIM 取得 31 で最適な角度を自動的に見つけたり、超解像顕微鏡 84,85 や多光子顕微鏡 86,87,88 で照明線量を調整したりするイメージングスキームが考案されています。さらに、サンプルの形態に合わせてイメージングボリュームを自動調整すると、イメージング時間と全体の光線量が大幅に減少し、サンプルの健康状態が改善されることがわかりました 89,90,91。

イメージングモダリティ間で変更するには (図 3c)、対象のイベントを検出するメカニズムが必要です。したがって、イベント検出は、いくつかの例を挙げると、今後の細胞分裂や細胞シグナル伝達などの生物学的構造または挙動の変化の早期識別に依存します。イベント駆動型顕微鏡法の初期の実装では、Almada et al.92 は、教師なしで高含有量のイベント駆動型サンプル処理とライブから固定までのイメージングを実行しました。したがって、彼らは、Otsu 閾値処理を使用したオンザフライ細胞セグメンテーションによって決定される、生物学的合図として有糸分裂細胞の丸まりに依存していました。 Alvelid et al.93 は、イベント検出のための広視野イメージングと STED 超解像度イメージングを組み合わせて、タンパク質動員、小胞輸送、およびバイオセンサー活性を高解像度で選択的にイメージングするための自動マルチスケール法を設計しました。 GPUによる高速ピーク検出を適用することで、ミリ秒単位のデータ処理を実現した。さらに、U-Net アーキテクチャ94 (図 3d) などの GPU ベースの深層学習ネットワークは、一度トレーニングされた大きな画像の本質的に高速な並列処理と、次のような特殊なハードウェアの積極的な開発により、イベント検出の大きな可能性を約束します。テンソルプロセッシングユニット (TPU)95。 Mahecic et al.96 は、このようなネットワークを今後のミトコンドリアと細菌の分裂のイベント検出に適用し、時間的ダイナミクスに一致する速度でこれらのプロセスの選択的高速イメージングを可能にしました。

現在、ライブイメージングがこのようなスマート収集スキームの主な推進力となっていますが、私たちはまた、それらがきれいな臓器、さらには動物全体の探索においても重要になることを想定しています。時間は大きな障壁ではありませんが、すべてのサンプルがもはや生きていない後でも、時間は依然として要因です。これは、繰り返しの実験、特に mm サイズの生検が日常的であり、予後の正確な細胞型の同定のために細胞分解能を達成する必要がある臨床現場で特に当てはまります。特に拡大顕微鏡の場合、大きく透明な組織を画像化することによって生成されるデータの量も過小評価することはできません。したがって、除去された組織を探索し、関心のある領域のみで高解像度のイメージングに自律的に切り替えるには、スマートイメージングスキームが非常に重要になります。

スマートな適応型顕微鏡ルーチンの中心となるのは、適応型制御スキームとイベント検出を可能にする顕微鏡制御ソフトウェアです。利用可能な実装では、オープンソース制御ソフトウェアの重要性が明らかになりました。オープンソースソフトウェアを使用すると、顕微鏡の取得のあらゆる側面を制御および変更し、利用可能な高速画像解析ソフトウェアと統合することができます。これらの取り組みは、Micro-Manager97、Pycro-Manager98、AutoScanJ99、またはその他の Python ベースの制御ソフトウェアなどのオープンソースソフトウェアによって主導されています100,101。オープンソースソフトウェアは少数の貢献者によって開発および保守されることが多いため、スクリプトを保守して新しいハードウェアに適応させ、新しいオンザフライ処理アルゴリズムを組み込むことは引き続き課題となります。したがって、ソフトウェアのモジュール性は不可欠であり、画像処理ワークフローのコンテナ化は互換性の維持に貢献し、1 台のコンピュータ上で複数のソフトウェア環境を可能にする可能性があります102、103。商用顕微鏡プロバイダーにとって、これらのオープンソースツールへのインターフェイスを提供することが最も重要であると考えています。これを実現する 1 つの方法は、取得プロトコルでネットワークメッセージによってトリガーされるイベントを有効にすることです99。

スマート顕微鏡と適応型顕微鏡の基礎は確立されましたが、スマート顕微鏡の時代は始まったばかりです。 AlphaFold104 による配列から構造への予測や GPT105 による大規模生成言語モデルなど、他の分野で深層学習ネットワークが達成した進歩を認識し、ユーザーが「すべてのエンドサイトーシスイベントを捕捉する」などのキーワードを入力できる顕微鏡実験を構想しています。そして、顕微鏡は標本内のこれらの現象を体系的に画像化します。

これには、基本的な生物学の概念における普遍的な基礎を備えた深層学習ネットワークをトレーニングし、生物学的用語を視覚顕微鏡の外観と関連付けることが必要になります。 Image Data Resource106 などの公開画像リポジトリの可用性が高まっていること、および出版物に関連するすべての画像データを利用可能にするという NIH の最近のガイドラインは、そのようなネットワークを訓練するこの方向への第一歩となる可能性があります。たとえば、注釈が不十分な大量の顕微鏡データが利用可能になると、顕微鏡用に予想される深層学習ネットワークをトレーニングする際の影響力が低下する可能性があります。重要なのは、自然言語とは異なり、画像は標準的な視覚的な「辞書」や「語彙」に束縛されておらず、同じ生物学であっても視覚的に重大な異質性を示していることです。単一の生物学的プロセスや研究室を超えて、トレーニング済みネットワークの一般化性と拡張性をどのように確保するかは未解決の問題のままです。さらに、そのような普遍的な顕微鏡ネットワークのトレーニングには多大なコストがかかる可能性が高く、現時点では個々の研究室はおろか、顕微鏡機関の手が届く範囲を超えています。これらの制限の一部を克服するために、自己監視型深層学習ネットワークは、スライド全体の組織学画像の大規模なリポジトリ内で、リポジトリ画像のサイズに依存せず、ほとんど注釈なしで同様の形態学的特徴を識別することに期待を示しています107。弱いまたは限定的な監視のみから学習する技術 108 や、エキスパート・イン・ザ・ループのアクティブラーニング 109 を導入して「困難な」ケースに注釈を付けて改良する技術の開発も、学習をスケールするための有望な費用効率の高い手段を提示する可能性があります。

同様の方法で、「教師なし」確率モデルは利用可能な画像の分布を学習して、まれなイベントを検索してこれまで知られていなかった生物学を明らかにできる可能性があります。人間のアノテーターによるこのような珍しい発見の例は、ゼブラフィッシュ脳血管系の長年の研究と画像化の結果、Kugeln110 と呼ばれるゼブラフィッシュ脳血管系の構造の発見です。将来的には、スマート顕微鏡自体がそのような発見をもたらすかもしれません。

ライトシート顕微鏡は数秒以内にギガバイトのデータを簡単に生成できるため、オンザフライ処理の現在のもう 1 つの制限は、データ処理に必要な時間です。ただし、近い将来、処理パイプラインの高速化に向けてかなりの進歩が見込まれると考えられます。この加速は、より優れたアルゴリズムの進歩に加えて、コンピューティングハードウェアの進歩によってもたらされます。現在のコンピュータアーキテクチャは依然として大部分が個別の分割された CPU メモリと GPU メモリに依存しているため、それらの間のデータ転送には低速が必要です。将来的には、顕微鏡の取得は、CPU と GPU によって共有される単一の物理メモリリソース (たとえば、現在 NVIDIA Jetson111 で利用可能) に依存するようになることが予想されます。これにより、CPU と GPU の間でのデータの往復コピーがなくなり、両方の長所を利用して、場合によってはカメラチップ上でも高速処理が可能です。そのため、顕微鏡検査は自動運転を可能にするツールの開発から恩恵を受ける可能性があり、膨大な数の画像がオンザフライで分析され、街路の危険物、他の車、歩行者を識別することができます。

スマートで適応的なイメージングスキームを使用して取得中にイメージングパラメータとモジュールを変更することに加えて、低解像度のスキャンまたは意図的に欠落領域を含むスキャンからの取得後に高解像度の画像データセットを再構築する取得スキームを考案できます。これにより、サンプルの全体的な光線量、取得されるデータ量、取得時間が大幅に削減される可能性があります。画像再構成後、元のイメージングシステムの解像度は回復、またはさらに向上し、従来のイメージングのトレードオフを克服します (図 3a)。圧縮センシング 112,113,114 および機械学習 115,116,117,118 アプローチによる画像再構成理論の進歩により、このようなアルゴリズムは将来さらに普及すると予想されます。

圧縮センシング 112、113、114 は、ナイキストレートを大幅に下回るレートで信号 (画像) をキャプチャして表現する方法を説明する数学的フレームワークです。圧縮センシングの理論は伝統的に、スパース性、インコヒーレンス、ランダムサンプリングという 3 つの概念に基づいています119。 3 つすべてが指定されていれば、アンダーサンプリングされた信号の再構築を成功させることができます。信号が少数の非ゼロパラメータのみを使用して特定のドメインまたは基底で表現できる場合、信号はスパースです。したがって、蛍光顕微鏡では、ピクセル表現がすでにまばらであることが多いため (たとえば、選択的にラベル付けされた構造がほとんどない)、または簡単に圧縮できるため、通常、スパーシティ制約が満たされます。これは、たとえばウェーブレットに基礎があることを意味します。多くのコンポーネントはゼロです。しかし、顕微鏡検査では、インコヒーレンス（測定行列内の値が均一に分散している）や均一なランダムサンプリングが欠けていることがよくあります119。結局のところ、現在のイメージセンサーは、ランダムな方法ではなく、2D アレイ上で決定論的にデータを取得します。それにもかかわらず、圧縮センシングの応用は成功裡に実証されており、理論と実践の間のギャップを埋めるために圧縮センシングの新しい原理、すなわち漸近的インコヒーレンス、漸近的スパース性、マルチレベルサンプリングが導入されています119。

画像処理や顕微鏡検査における圧縮センシングの応用例がいくつか実証されています120。これらのアプリケーションには、1 秒あたり 1,000 億フレームに達する、大幅に加速されたカメラのフレームレートが含まれます121。さらに、圧縮センシングは格子ライトシート顕微鏡と落射蛍光顕微鏡に実装されており、露光時間と取得時間を 5 ～ 10 分の 122 に短縮し、122 程度のタイムスケールで ~400 mm3 のマウス脳全体のハイスループット解剖学的イメージングに適用されています。～10分123。重要なのは、圧縮センシングの再構成は教師なしであり、事前のトレーニングデータを必要としないことです。さらに、解像度が増加するにつれて再構成精度も向上します124。このため、圧縮センシングは、マルチ解像度のスマートライトシートイメージング方式の将来にとって魅力的な技術となります。

同様に、深層学習ネットワークはトレーニングデータから画像復元を学習できます125、126、127。これにより、深層学習は圧縮センシングのいくつかの制限に対処できます126。従来、圧縮されたセンシングには手作りの再構成手順が必要でしたが、高度な画像モデルを確立するのは困難な場合がありました。さらに、そのような再構成手順は反復逆最適化アルゴリズムに基づいており、正確に調整するには時間がかかり、繊細な傾向があるため、リアルタイムで再構成を達成するのは困難です。対照的に、深層学習による再構築には、ネットワークを介した単一の高速順伝播のみが必要です。さらに、圧縮センシングに必要なデータの（漸近的）インコヒーレンスは、深層学習ネットワークには厳密には必要ありませんが、対照的に、コヒーレントなデータから恩恵を受ける可能性があります。したがって、当然のことながら、画像再構成のための深層学習の応用は非常に活発な研究分野であり、このタスクのためにさまざまなネットワークが開発されています126,127。

ただし、ディープラーニングはいくつかの課題に直面しています。深層学習モデルは、確立された圧縮センシングによって提供される再構成の一般化、堅牢性、安定性をまだ提供しておらず、幻覚、つまり現実的に見えるアーティファクトの作成に悩まされています127,128。これは、よく訓練されたネットワークが訓練セットの外でどのように一般化するか、およびモデルの公平性、つまり一般的な表現型とまれな表現型の両方を均等に捕捉して表現するモデルの能力の問題に関連しています。これらの問題に対処するために、今後数年間でかなりの進歩が見込まれると予想されます。したがって、不確実性を定量化して報告することは、再構成を解釈する上で非常に重要になります。この目的を達成するために、深層学習モデルから不確実性の尺度を生成するために、ベイジアン逆変換 129 などのモデルやベイジアンドロップアウト 130 などの手法が存在します。ただし、不確実性測定の精度については、偶発的および認識的不確実性を説明できる能力を確認するために、さらなる外部評価が必要です131,132。

さらに、深層学習ネットワークのデータ駆動型アプローチは、目的のアプリケーションを反映した良好な (サイズ、バランス、品質の) トレーニングデータの利用可能性に依存します。これは、本質的に粗いデータである分類タスクや（バイナリ）セグメンテーションとは対照的に、最高解像度データによる出力を必要とする画像再構成に特に当てはまります。ただし、GPT105 などの一般的なネットワークは限られた制限付きで利用可能な豊富なデータに依存していますが、顕微鏡画像再構成タスクは通常、小規模なデータセットを使用する特殊なアプリケーションです。将来的には、出版物に付随するすべての顕微鏡データをホストすることが義務付けられ、より多くのより優れた注釈付きトレーニングデータが最終的に利用可能になることが 1 つの希望です。さらに、例えば画像の回転などの幾何学的変換によるデータの増強により、データサイズが増加する可能性があります133。さらに、より多様で大規模なデータセット上のさまざまなタスク用に事前トレーニングされた深層学習ネットワークの適用は有益である可能性があり、これは転移学習として知られる概念です134。さらに、少数のイメージ設定でネットワークを特別にトレーニングするためのメタ学習アプローチ 135,136 により、実際の展開ではよりパフォーマンスの高いネットワークが得られる可能性があります。同様に、画像生成プロセスをモデル化する、より物理的な情報に基づいた深層学習ネットワークアーキテクチャは、現実的な予測を保証し、より高速でより一般化可能な学習に適合するように自由パラメータの数を減らすのに役立ちます 137,138。最後に、1 回限りのトレーニングではなく継続的な学習パラダイムを採用すると、新しいデータやイメージング条件に継続的に適応できる可能性があります。

こうした懸念にもかかわらず、深層学習復元技術はうまく適用されており、CT スキャンなどの一部の用途に対して FDA の承認さえ得ています139。超解像顕微鏡では、修復により取得速度の大幅な向上が報告されています140,141,142。ライトシート顕微鏡の場合、CARE143 などの深層学習ネットワークにより、より少ないレーザー出力またはより高速な露光で取得された画像の SNR 比が向上しました。興味深いことに、深層学習ネットワークはサンプリングプロセスに直接影響を与えるためにも適用されています。ホーストマイヤーら。畳み込みニューラルネットワークを開発して顕微鏡の物理レイアウトを最適化し、マラリア感染細胞の識別精度を 5 ～ 10% 向上させました 144。私たちは、将来の開発では、画像取得と分析用の深層学習ネットワークを共同最適化するというこの手段をさらに活用することを期待しています。イメージングシステムとプロセスの両方を理解することで、処理時間の短縮と再構成の改善につながります 138。

最終的には、多くの場合、画像は生物学的プロセスの定量化への中間ステップであることを認識することも重要です。したがって、多くの研究では、視覚的に魅力的な深層学習再構成画像は、厳密に定量化可能な結論を含む画像データを持つことよりも重要ではない可能性があります。これにより、上記の課題の一部が軽減される可能性がありますが、イメージングシステムと画像形成について正確に理解する必要があります。この目的に向けて、Pégard et al. 彼らは、圧縮光場顕微鏡法を実証し、3D 画像を再構成することなく脳活動のリアルタイムの定量化を可能にしました 145。

私たちは、ライトシート技術自体が、洗練された光学設計、より優れた検出器、新しいプローブ、NIRイメージング機能、そしてラマン散乱などの潜在的に非蛍光コントラスト法という形で進歩すると予想しています。ただし、ライトシート顕微鏡でカバーできる開口数など、ライトシート技術のいくつかの技術的側面は最大限に最適化される可能性があります146、147。この分野でさらなる進歩があれば、おそらくこの機器の実用性も低下するでしょう。これは、LSFM の直交構成と、高 NA 対物レンズには大きな開口角が必要であるという事実によって決まります。その結果、励起光円錐と検出光円錐が共有する立体角が限られているため、一定の閾値を超えて横方向分解能を向上させると軸方向分解能が低下するという犠牲が発生し、逆も同様です。

むしろ、ライトシートシステムの将来の影響は、その実用性と生物学および生物医学の研究課題への適用可能性に大きく依存すると考えています。従来のライトシート設計の多くは、従来とは異なるサンプルの取り付けを必要とし 5,36、サンプル自体のためのスペースが限られています (図 1a)。

有望な代替手段は、オープントップ顕微鏡 37,148 および斜平面顕微鏡 (OPM) 8,28,149 であり、原則として任意のサイズのサンプルを配置するために半分のスペースを空けておきます (図 4a)。これらの顕微鏡の光学設計の進歩により、ミリメートルサイズの大きな視野を備えた顕微鏡150、151、152、153、154や高解像度の顕微鏡8,155、さらには両方のモダリティを備えた顕微鏡156が可能になりました。最近では、市販の顕微鏡もオープントップ顕微鏡法に基づいて開発されています157。そのため、従来のサンプル取り付け方法を採用でき、OPM では標準的な顕微鏡本体への統合が原理的に可能であるため、オープントップおよび OPM システムによってライトシート顕微鏡の広範な採用が可能になると考えています。これにより、マルチウェルプレートを使用した三次元ハイスループットイメージング、（密封された）ディッシュに含まれる有毒または感染性検体のイメージング、およびマルチモーダルイメージングアプローチへの道が開かれます（図4b）。

斜平面ライトシート顕微鏡 (OPM) は、オープントップジオメトリの一例であり、高 NA の主対物レンズが照明 (青色) と検出 (ライトシートに沿った 3 つの蛍光発光体、濃い緑色で示されている) の両方を提供します。緑色は、OPM によってこれら 3 つのエミッターから収集された蛍光を示します)。これにより、従来のライトシート顕微鏡のような追加の照明対物レンズの必要性がなくなり、新たに利用可能な光学設計スペースが提供され、アクセシビリティが向上します。 3D ボリュームをスキャンするには、ライトシートが対物レンズ全体でスキャンされ、ステージやサンプルの移動は必要ありません。 b OPM は、(i) 新しいハイスループットのマルチウェルアプリケーションおよびマイクロ流体デバイスのライトシート顕微鏡検査、(ii) 長期間にわたる汚染を軽減するために密閉された新しいプローブのイメージング、および細菌や細菌などの病原体のイメージングを容易にします。ウイルス、(iii) 原子間力顕微鏡 (AFM) などの他の検査法との組み合わせ。

オープントップと OPM は、光学工学に新しい設計空間も開きました。 OPM は、サンプルから離れた遠隔空間でサンプルの収差のない 3D 画像を作成する機能を説明するリモートリフォーカス 158 に依存しています。その 3D 画像内の傾斜したライトシート平面は、別の顕微鏡を使用してカメラにマッピングできます。 OPM の基礎となるリモートフォーカシング原理 158 は 10 年以上前に確立されていますが、最近再分析され 159 、異なる屈折率にわたるイメージングが可能になりました。新しい発見により、あらゆる液浸媒体での高解像度ライトシートイメージングが可能になり、ライトシート顕微鏡法の多用途性と適用性がさらに高まる可能性があります。これは、工学だけでなく光学原理や理論の発見からも改善がどのようにもたらされるかを示す一例にすぎません。

私たちは、ライトシート顕微鏡法が将来、生物医学科学や顕微鏡および巨視的イメージングの臨床応用において重要な役割を果たすと期待しています。迅速かつ穏やかな体積イメージングの組み合わせは、細胞培養、オルガノイド、（人工）組織、臨床生検、および動物全体における細胞生物学の生理学的に関連した研究の基礎として機能します。そのため、カバーガラス上での従来の細胞培養法による制限を受けることなく、細胞内生物学を本来の文脈で生きたまま研究できる未来という大きな夢を抱くことができます。

この夢を達成するために、私たちはライトシート顕微鏡が顕微鏡システムとサンプルの制約によって課せられる体積的および時間的イメージングの障壁を克服することを期待しています。これは、もはや人間の顕微鏡オペレーターや画像解析者が単独で処理できるタスクではなくなります。代わりに、新しいスマートで適応性のある顕微鏡制御スキームが自律的、自動運転方式でサンプルを探索し、対象のプロセスをそのダイナミクスに一致する速度で選択的に画像化します。これらのスキームにより、新たな自律的な生物学的発見や、複数の長さおよびタイムスケールにわたって起こるプロセスの体系的なイメージング研究が可能になります。

このような取得スキームは、スループットの向上に加えて、データの氾濫を抑制することも期待できます。現在のライトシートデータはすでにペタバイト規模に達する可能性があり、近いうちにさらに大きな規模に達する可能性があります。スマートで適応的なデータ収集スキームは、データセット全体にわたって最も細かいレベルのナイキストサンプリングに従わなくなるため、最も細かいサンプリングは選択的にのみ適用されます。さらに、アルゴリズムによる関心領域の選択により人間の偏見が排除され、画像研究の再現性が向上します。

将来を展望するときと同様に、この分野はまったく異なる方向に進む可能性があります。結局のところ、想像を絶する形で蛍光顕微鏡に影響を与えた拡大顕微鏡法を 2015 年以前に誰が予想したでしょうか 54,55 。したがって、私たちはここで説明した可能性に興奮している一方で、顕微鏡コミュニティが過去 20 年間と同じように想像力豊かであり続け、さらに多くの驚きを待ち構えていることを願っています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

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国立衛生研究所 (助成金番号 R35GM133522) のご支援に感謝いたします。著者らは、この原稿に関するコメントとフィードバックをくださったアンナ・バジュール博士、ケビン・ディーン博士、フェリックス・チョウ博士に感謝します。

Lyda Hill 生物情報学部、テキサス大学サウスウェスタン医療センター、米国テキサス州ダラス

ステファン・デトワイラー & レト・ポール・フィオルカ

テキサス大学サウスウェスタン医療センター、細胞生物学部、米国テキサス州ダラス

ステファン・デトワイラー & レト・ポール・フィオルカ

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SD と RF が概念化して原稿を書きました。

レト・ポール・フィオルカへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: Manuel Breuer。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Daetwyler, S.、Fiolka, RP ライトシートとスマート顕微鏡、エキサイティングな未来が幕を開けています。 Commun Biol 6、502 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04857-4

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受信日: 2023 年 2 月 4 日

受理日: 2023 年 4 月 20 日

公開日: 2023 年 5 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04857-4

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