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ISME Journal (2023)この記事を引用する

メトリクスの詳細

マルチオミクス解析は、複雑なバイオガスを生成する微生物群集の細菌と古細菌間の相互作用など、界間の相互作用を検出および研究するための強力なツールです。本研究では、それぞれに異なる基質を供給した 3 つの工業規模のバイオガス消化装置のマイクロバイオームを、メタトランスクリプトームデータで補完された機械学習誘導のゲノム中心のメタゲノミクスフレームワークを使用して分析しました。このデータにより、豊富なコアメタン生成コミュニティとその共栄養パートナーとの関係を解明することができました。合計 297 個の高品質で重複のないメタゲノム構築ゲノム (nrMAG) が検出されました。さらに、これらのnrMAGの組み立てられた16 S rRNA遺伝子プロファイルは、ファーミクテス門が最も高いコピー数を有し、一方、古細菌ドメインの代表が最も低いコピー数を有することを示した。 3 つの嫌気性微生物群集をさらに調査したところ、時間の経過とともに特徴的な変化が見られましたが、依然として各産業規模のバイオガスプラントに特有の変化が見られました。メタゲノムデータによって明らかにされたさまざまな微生物の相対存在量は、対応するメタトランスクリプトーム活性データとは独立していました。古細菌は、その豊富さから予想されるよりもかなり高い活動を示しました。 3 つのバイオガス植物マイクロバイオームすべてに異なる存在量で存在する 51 個の nrMAG が検出されました。コアマイクロバイオームは主要な化学発酵パラメータと相関しており、群集構成の主要な形成要因となる個別のパラメータは存在しませんでした。農業バイオマスと廃水を利用して稼働するバイオガスプラント内の水素栄養栄養性メタン生成菌には、さまざまな種間の H2/電子伝達機構が割り当てられました。メタトランスクリプトームデータの分析により、メタン生成経路がすべての主要な代謝経路の中で最も活性であることが明らかになりました。

工学的に設計された嫌気性消化システム (AD) では、有機物の分解とバイオガスの生成は、効率的な栄養素のリサイクルに基づいています [1、2]。このプロセスには多様な微生物群集が関与しており、各微生物は特定の役割を持っています。アルツハイマー病の段階に関与する微生物群集の組成と機能は、プロセス全体の効率に重要な役割を果たしますが、これは微生物間の相互作用、基質組成、物理化学的パラメータ、操作条件などの多数の要因にも影響されます。 [3、4、5、6]。

多くの微生物は特定の微生物パートナーなしでは生存できないため、微生物の相互作用とその根底にあるメカニズムを解明することは複雑な作業です[7]。微生物の分離と培養のための革新的な方法が開発されており、その中には新しい微生物を培養に導入することに成功したものもある[8]。しかし、微生物の多様性の可能性を最大限に引き出すには、これらの技術のさらなる開発と進歩が必要です[9、10]。アルツハイマー病微生物コンソーシアム内の微生物間には強力な共栄養相互作用があるため、それらの多様性、代謝的役割、分布を理解するには詳細な研究が必要です。これらの研究は当初、微生物の単離が必要であり、共栄養関係が遍在する場合には困難となる可能性がある、培養依存性の微生物学的方法に固有の制限によって妨げられてきました[11、12、13]。ハイスループットのシーケンシングおよびバイオインフォマティクスツールにより、ゲノム物質の一括分析が可能になり、微生物群集全体の分類と機能についての洞察が得られます[14、15、16]。

AD マイクロバイオームで一般的に見られる微生物の同定とゲノムの特徴付けにより、微生物の食物連鎖に関与する重要な経路と生態学的特徴が明らかになる可能性があります [17、18]。 16 S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定を使用した以前の研究では、コア微生物がさまざまな摂動 (つまり、AD パラメーターの変化) に抵抗できる安定したコミュニティを作成することが示されました [19、20、21]。しかし、アンプリコン配列決定およびリードベースのメタゲノミクスアプローチは、参照データベースに依存しているため、コアマイクロバイオーム分析によって未知の種を同定できない可能性がある[22、23]。さらに、バイオガス生成コミュニティは、これまでに「微生物の暗黒物質」として説明されてきた、特徴づけられていない微生物の大規模かつ多様な集団を表しています [19、24、25]。この問題に対処するために、ますます洗練されたバイオインフォマティクスアルゴリズムを使用して、これらの複雑なコミュニティから個々の種のゲノム（またはMAG：メタゲノム構築ゲノム）を再構成できます[26、27、28]。

ゲノム分解メタゲノミクスを利用したいくつかの最近の研究では、研究室および産業規模のバイオガス反応器から特徴的な MAG が回収されています [23、29、30、31]。これらの研究により、バクテロイデス属とファーミクテス属は、H2、CO2、およびギ酸生成能力を通じて水素栄養性メタン生成菌と多様な相互作用を持っていることが明らかになりました[17、32]。さらに、アンモニア濃度はメタン生成菌群集を形成する主要なパラメーターである[29]。これらの相互作用をコンピュータで調査するには、効率的かつ正確な方法でメタゲノムからゲノム断片を再構成する必要がある[33、34]。最近発表された研究では、半教師あり機械学習によってビニングのパフォーマンスが大幅に向上する可能性があることが実証されており [35、36]、メタトランスクリプトミクスのアプローチと組み合わせることで、さまざまな環境における微生物の相互作用をより詳細に調べることが可能になる可能性があります。

本研究では、それぞれに異なる特徴的な基質を供給した 3 つの工業用サイズのバイオガス反応器におけるマイクロバイオームの構造と機能を調査しました。各原子炉は 1 年間にわたって季節ごとに監視されました。ショットガンシークエンシングに続いて、機械学習に基づくゲノム中心のメタゲノムおよびメタトランスクリプトーム解析フレームワークを使用して、微生物の組成と進行中の代謝活動を特定しました。異種基質の消化に関与する微生物群集の共有部分は、出現ベースのコア群集概念を使用して調査されました [37]。この研究の主な目的は、豊富なコアメタン生成菌集団と特定の共栄養細菌との関係を明らかにすることでした。より具体的には、私たちは種間シントロフィーの主要なネットワークに焦点を当て、化学発酵パラメータとリアクター内に存在する中心的な嫌気性微生物叢との間の興味深い相関関係を発見しました。

サンプルは、ハンガリーにある 3 つの最先端の嫌気性消化装置から採取されました。消化槽のうち 2 つはセゲド (MWBP および SZBP) にあり、もう 1 つはケチケメート (KBP) にあります。ここで研究した各バイオガスプラントの主な特徴は、付録にまとめられています。表 1. これらのバイオガスプラントは、次の基準を使用して選択されました。(i) 消化槽は 5 年以上問題なく稼働しています。 (ii) 消化装置は、バイオガス生産のための主な分解基質として異なるバイオポリマーを使用します。サンプリングは、2020 年 10 月、2021 年 1 月、2021 年 4 月、2021 年 7 月の (季節的な) 間隔で 1 年間実施されました。サンプルは研究室に直接輸送され、到着後すぐに処理されました。 AD パラメーターの測定と DNA/RNA 精製は、新鮮なバイオガスプラント (BP) サンプルに対して 3 回繰り返して実行されました (つまり、生物学的 3 回繰り返し: n = 3)。

各 BP について、汚泥の pH、炭素と窒素の比 (C/N)、全固形物 (TS) 含有量、揮発性固形分 (VS) 含有量、全アンモニア態窒素 (TAN、つまりアンモニウムイオンと溶存アンモニア)、揮発性物質を測定しました。有機酸（VOA）含有量、および全無機炭素（TIC）。測定は以前に公開されたとおりに行われました[38]。

生化学的メタンポテンシャル (BMP) バッチ試験は、60 mL の液相を含む 160 mL 反応容器 (Wheaton ガラス血清ボトル、Z114014 Sigma-Aldrich) で実行されました。接種材料（２ｍｍより大きい粒子を除去するためにフィルタリングされたＢＰ含量）対基質（α－セルロース：Ｃ８００２ Sigma-Aldrich）の比は、ＶＤＩ４６３０標準（Vereins Deutscher Ingenieure 4630, 2006）に従って、接種材料対基質のＶＳ比に設定した。 = 2:1。ガスのサンプリングと測定手順の詳細な説明は、以前の出版物 [39] に記載されています。

コミュニティ全体の DNA および RNA を単離するために、各 BP のサンプルから 2 mL のアリコートが得られました。精製は 3 回行い、得られた抽出物を一緒にプールしました。すべての抽出は、ZymoBIOMICS DNA/RNA ミニプレップキット (R2002、Zymo Research、アーバイン、米国) を使用して実行されました。溶解後 (ビーズの均質化は、ビーズサイズ 0.1 mm、均質化時間 15 分間、最大速度で Vortex Genie 2 を使用して実行されました)、Zymo Research キットの平行した DNA および RNA 精製プロトコルに従いました。 DNA および RNA の量は、Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies、サンタクララ、米国) を使用して推定されました。

私たちは、Illumina シーケンスプラットフォーム (Illumina Inc.、サンディエゴ、米国) に関するすべてのメーカー推奨事項に厳密に従いました。プールされたゲノム DNA サンプルを使用して、NEBNext Ultra II Library Prep Kit (NEB、イプスウィッチ、米国) を使用して構築されたライブラリーの配列を決定しました。ペアエンドメタゲノミクスシーケンスは、NextSeq High Output Kit v2 シーケンス試薬キットを使用して NextSeq 550 (Illumina) シーケンサーで実行されました。プールされた RNA サンプルからのメタトランスクリプトームシークエンシングは、次のように実行されました。ライブラリは、最初に、ユニバーサル rRNA 枯渇ステップを含む Zymo-Seq RiboFree Total RNA ライブラリキットを使用して調製されました。次に、NextSeq High Output Kit v2 シーケンス試薬キットを使用して、NextSeq 550 (Illumina) シーケンサーでペアエンド mRNA シーケンスを実行しました。一次データ分析（すなわち、塩基呼び出し）は、「bcl2fastq」ソフトウェア（バージョン2.17.1.14、Illumina）を使用して実行した。特徴的なフラグメントパラメータを補足表 2 にまとめます。

生の配列を fastp (バージョン 0.23.2、必要な長さ: 150 bp) でフィルターし、FastQC (バージョン 0.11.8) でチェックしました。 fastp によって生成されたフィルター処理されたシーケンスは、Megahit によって個別に同時アセンブリされました (バージョン 1.2.9、BP ごとに 4 つのサンプル = 3 つの同時アセンブリ)。使用した設定は次のとおりです。最小コンティグ長 = 1500。最小k-merサイズ = 21; 最大 k-mer サイズ = 141 [40]。メタゲノミクスビニング手順は、複製解除ステップまで各 AD メタゲノミクスデータセットに対して個別に実行されました。 Anvi'o (バージョン 7: "hope") を使用して、次のメタゲノミクスワークフロー用のコンティグデータベースを作成しました [41]。

ゲノム再構成は、半教師ありモードの高度な共アセンブリビニングワークフローを使用することで、半教師ありアプローチとディープシャムニューラルネットワークを組み合わせた機械学習ガイド付きソフトウェアパッケージである Semibin (バージョン 1.1.1) を使用して実行されました [35] ]。メタゲノム構築ゲノム (MAG) の複製解除と高品質フィルタリングには、dRep (バージョン 2.2.3) と CheckM2 (バージョン 1.0.1) を次のパラメーターとともに使用しました: dereplicate: comp 10、con 5、S_algorithm fastANI、sa 0.95、 CheckM2 の場合の予測関数 [42, 43]。 dRep は CheckM1 を使用するため、nrMAG の汚染は dRep フィルタリング設定とは異なる可能性があることに注意してください (補足表 3)。 MarkerMAG をデフォルトモードで使用して、16 S rRNA 遺伝子を検出、アセンブルし、MAG にリンクし、対応するコピー数を計算しました (matam_16s: pct 5,10,25,50,75,100 –i 0.99、およびデフォルトパラメーターのリンク関数) [ 44]。

オープンリーディングフレーム (ORF) は Prodigal (バージョン 2.6.3) によって特定されました。 InterProScan バージョン 5.31–70 は、Pfam データベースを使用して遺伝子コード配列に機能的に注釈を付けるために使用されました [45]。機能プロファイルは、Anvi'o (anvi-run-kegg-kofams) による京都遺伝子ゲノム百科事典 (KEGG) 機能モジュールからのデータを使用して補足されました [46]。炭水化物の利用に関与する酵素は、Pfam の機能プロファイルと炭水化物活性酵素データベース (CAZy) からのデータの組み合わせを使用して同定されました [47]。次に、分類学的割り当てのためにゲノム分類データベース (GTDB: リリース 207) と GTDB-Tk (バージョン 2.1.1) を使用しました [48]。 90% 以上の完全性を示した再構成された非冗長 MAG (nrMAG) も、fastANI (バージョン 1.33) [49] を使用して Biogas Microbiome データベース [29] のエントリと比較されました。 nrMAG 統計は補足表 3 にまとめられています。

各サンプルの nrMAG の存在量の値は、TPM (100 万あたりの転写) 計算プロセスと同様に、MetaWRAP (バージョン: 1.3.2) quant_bin モジュール (Salmon を使用) で計算されました。ここでは「100 万読み取りあたりのコピー数」を指します ( CPM; 補足表 4) [50]。リードは nrMAG のコンティグにアライメントされ、結果のカバレッジ値はサンプルサイズ (100 万メタゲノムリードごと) およびコンティグの長さ (ヌクレオチド単位) によって標準化されました。系統樹は、GTDB-Tk (バージョン 2.1.1、classify_wf) および IQTree2 (バージョン 2.2.0.3) を介して、120 個の細菌および 53 個の古細菌のシングルコピーコア遺伝子 (SCG) のセットを使用して生成されました。次のパラメーターを使用しました: ブートストラップの数: 1000; 最大反復: 1000; 停止ルール: 100 [51, 52]。インタラクティブな Tree of Life (iTOL: バージョン 6.7.3; https://itol.embl.de/) ツールを使用して、系統樹といくつかのビニング結果を視覚化しました。

まず、bedtools:getfasta (バージョン: 2.27.1) を使用して MAG から ORF を抽出し、MAG 固有の遺伝子コールを取得しました。次に、これらを結合して Salmon インデックスを作成しました (パラメータ keepDuplicates を使用; https://github.com/COMBINE-lab/salmon)。読み取りカウントは、GC バイアス補正 (gcBias) を備えた準マッピングモードの Salmon (バージョン 1.8.0) で計算されました。メイン出力ファイル (quants.sf) には、定量化された読み取り数 (numReads) とその数量 (TPM 値) が含まれています (補足表 5)。 TPM 計算プロセス (本研究では活性メトリクスとして使用) は、前述と同様に、有効長重み付け遺伝子 (GC バイアス) とサンプル補正ごとのマップされたトランスクリプトームリードを取得して実行されました。

BMP テスト結果は ggplot2 (バージョン 4.1.3) によって視覚化され、最大バイオガスポテンシャル (つまり、α-セルロースを使用したバッチテストから) 間の有意差は、ggsignif (バージョン 0.6.4) パッケージを使用して計算されました (つまり、間の-複数のグループを比較するために一元配置分散分析を使用したウィルコクソン検定のペア) [53]。サンプルの多次元スケーリング (つまり、Bray-Curtis の非類似性を表示する MDS プロット)、MAG 存在量、および活性値は、microViz (バージョン 0.9.0) によって視覚化されました [54]。サンプル間のユークレディアン距離と差異は計算され（順列多変量分散分析、PERMANOVA: n_perms: 1000 を使用）、microeco R パッケージ（バージョン 0.14.1）によって視覚化されました [55]。 MAG 間の差異の有意性を評価するために、microeco 内で lefser (線形判別分析効果量計算用の R パッケージ、バージョン 4.3) を使用し、有意性しきい値 p ≤ 0.05 (trans_diff: alpha = 0.05、p_adjust_method = fdr、lefse_min_subsam) を設定しました。 = 10、lefse_norm = 1e + 06、ブーツ = 30) [56]。

次に、発生データを分析して、コアマイクロバイオームを特定しました。サンプルの 83.3% (つまり 12 個中 10 個) で観察され、存在量が 1 を超える分類群 (ゲノム範囲の約 10 倍) は、コアマイクロバイオームのメンバーであると考えられました [37]。 ggvenn および ggtern パッケージ (バージョン 0.1.10 および 3.4.1) は、BP 間のコアマイクロバイオームの (種および門レベルでの) 分布を視覚化するために使用されました [53]。 AD パラメーターとコアマイクロバイオームメンバーの分類学的 ID (種レベルまたはその他の最高の分類学的レベル) 間の共起分析と相関関係は、microeco によって計算されました [55]。関連行列の計算と正規化には NetComi (マイクロバイオームデータのネットワーク構築と比較、バージョン 1.1.0) を利用しました (trans_network: cor_method = pearson、use_NetCoMi_pearson_spearman = TRUE、filter_thres = 0.001、次に cal_network: COR_p_thres = 0.01、COR_cut = 0.7)。 [57、58]。相関関係を視覚化するために、ggraph パッケージ (バージョン 2.1.0) が使用されました。微生物と化学パラメーター間の相関関係を明らかにするために、trans_env 関数が使用されました (use_data = Species、cor_method = pearson、p_adjust_method: fdr)。

炭水化物活性酵素のメタゲノミクスおよびメタトランスクリプトーム解析の結果は、Circos オンライン (http://circos.ca/) および ggplot2 によって視覚化されました。差次的遺伝子発現および濃縮分析は、R に実装された DESeq2 パッケージ (1.34.0) によって行われました [59]。 Salmon quant ファイル (quants.sf) は、tximport (バージョン 1.22.0; 設定: type = Salmon、txOut = TRUE) (https://github.com/mikelove/tximport) を使用して R にインポートされました。 Salmon アライメント (numReads) から取得され、DESeq2 によって正規化された 4 つのサンプルにわたって、少なくとも 5 つのリードを持つ遺伝子を保持するためにカウントをフィルター処理しました (デフォルトのパラメーターを使用; 補足表 5)。最後に、大きく異なる遺伝子を視覚化するために、ggplot2 パッケージを使用しました (次の設定を使用: log2 FC: ≥2.0、p ≤ 0.05)。

サンプルは、3 つの工業規模の BP の嫌気性消化槽から収集されました (「AD サンプル」および補足表 1)。 KBPには主に鶏糞と前処理された小麦わらが与えられました。 SZBP には豚のスラリーとトウモロコシのサイレージが与えられました。 MWBP はさまざまな物質を含む都市下水汚泥を処理しました。すべての蒸解缶は、連続的に撹拌されるタンク反応器内で中温温度（すなわち、36℃～38℃）で運転されました。季節監視期間中（つまり、BP ごとに 4 つのサンプリングポイント）、すべての原子炉は安定して運転され、故障は報告されませんでした。

異なる AD コミュニティの最大バイオガス潜在力を測定するために、標準的な BMP テストを実行しました (「AD 化学パラメーターの決定」の詳細を参照)。メタン収量は 340 mL (標準偏差: 2.6 mL) から 376 mL g VS-1 (SD: 14.6 mL) まで変化しました。 BMP テストの接種材料は、異なる基質を供給した蒸解釜に由来しますが、メタン収量は非常に類似していました (図 1A)。さらに、10 月、1 月、4 月、7 月の時点でのテストはすべて、3 つのバイオガスプラント間で同様のメタン収量を示しました (図 1B; 4 月の場合: KBP = 362 ± 14.6、MWBP = 356 ± 2.4、および SZBP = 365 ± 7.6 mL メタン g VS-1)。以前の調査では、農業または都市起源のさまざまな種類のバイオマスを消化するBPで同様のメタンポテンシャル範囲が観察されました[60、61、62]。

A 3 つの BP の標準的な BMP テスト測定の結果 (「AD サンプル」を参照)。 B 試験期間中の BMP メタン収量。 C 個々の BP 蒸解装置からの汚泥の嫌気性消化化学パラメーター (C/N 炭素対窒素比、TAN 総アンモニア窒素、VOA 揮発性有機酸、TIC 総無機炭素、TS 総固形分、VS 揮発性固形分)。平均差は ANOVA によって分析され、次のように統計的に有意であるとみなされました: p < 0.05 (*)、p < 0.001 (**)、ns は有意差なし。

主要な化学プロセスパラメータは最適範囲内にありましたが [63、64、65]、3 つの BP 反応器間で明らかな違いが示されました (補足表 1)。以下のパラメータが測定されました: 揮発性有機酸 (VOA)、全無機炭素 (TIC)、全アンモニア態窒素 (TAN)、炭素対窒素比 (C/N)、全固形分 (TS)、および揮発性固形分 (VS) ）。これらのうち、C/N、VOA、および TAN 濃度は、BP 間で最も大きなばらつきを示しました (ANOVA: p < 0.05) (図 1C)。これらの値は通常、KBP および SZBP に比べて MWBP の方が低かった (p < 0.01) [66]。

機械学習 (ML) で補完された半教師ありビニングは、微生物ゲノミクスの知識を拡張するのに非常に有益であることが証明された最近開発されたアプローチです。以前の研究では、ML ベースの生息地固有モデルが複雑なマイクロバイオームのメタゲノムビニングプロセスを強化し、既存の教師なしヌクレオチド組成や存在量ベースの方法 (つまり Metabat2) を上回るパフォーマンスを示すことが示されています [35、36]。しかし、異常なリード深さと非定型的なヌクレオチド組成のため、ショートリード配列データから回収された MAG にはリボソーム RNA 遺伝子が存在しないことがよくあります [34、44]。これらの遺伝子は、未培養微生物のゲノミクスおよび系統発生を研究するために不可欠であり、MAG データを 16 S rRNA 遺伝子データベースと接続する分析を可能にします。

本研究では、2 億 9,600 万を超えるメタゲノムシーケンスリードがフィルタリングステップを通過しました (サンプルあたり平均 2,460 万リード)。フィルターされたリードは Megahit によって同時アセンブリされ (BP ごとに 3 つの独立したアセンブリ)、合計 283,491 個のコンティグが得られました (KBP: 107,920; MWBP: 98,415; SZBP: 77,156 コンティグ; 詳細については、補足表 2 を参照)。ゲノム中心のメタゲノミクス戦略が、共組み立てされたコンティグセットごとに適用されました。その後、複製が解除され、品質フィルタリングされた MAG のセットがさらなる分析に使用されました。 Semibin は 297 個の nrMAG (nr = 非冗長) を生成し、そのうち 107 個 (36%) は 90% 以上の完全性を持っていました。 CheckM2 分析により、nrMAG の 6% が 0% の汚染を含むことが特定され、さらに 90% が >5% の汚染を含むことが特定されたことは注目に値します (図 2A および B)。さらに、nrMAG の 24% (n = 70) が、ゲノム分類データベースの代表的なものよりも高い品質レベルで特定されました (補足表 3)。これらの観察は、複雑な嫌気性バイオガス生成コミュニティのビニング手順としてのセミビンの有効性を裏付けています[35]。さらに、Semibin によってビン化された多数の固有の nrMAG も、メタトランスクリプトームデータのマッピングの向上につながる可能性があります。

Semibin によって生成され、デフォルトの SCG セットを使用して CheckM2 によって分析された非冗長メタゲノム構築ゲノム (nrMAG) の完全性と汚染の比較。 B 完全性と汚染に基づいて Semibin によって再構築された nrMAG の分布。 dRep が CheckM1 を採用していることを考慮すると、nrMAG の汚染は dRep フィルタリング設定と異なる可能性があります。 C 22 門 (つまり、2 つの古細菌分類群と 20 の細菌分類群) の推定 16 S rRNA 遺伝子コピー数。いくつかの門では、代表的な 1 つのコピー数を決定することができました: メタノバクテリオタ門、ファーミクテス F 門、ファーミクテス D 門、プランクトミセトータ門、プロテオバクテリア門、およびサーモトゴ門門。

次に、MarkerMAG プログラムを使用して、メタゲノムから 16 S rRNA 遺伝子を検出、アセンブル、および MAG にリンクし、コピー数を推定しました (材料と方法の「メタゲノムのアセンブリとビニング」および補足の表 3 を参照) [44]。本研究では、22 門に分布する 82 個の nrMAG で 16 個の S rRNA 遺伝子 (最小長: 1200 ヌクレオチド) が検出されました (全 nrMAG の 28% に相当)。ファーミキューテス属の代表者は、この遺伝子の最も高い推定平均コピー数（3.6 コピー）を所有していましたが、ハロバクテリオータ属とメタノバクテリオータ属のメンバーは、それぞれ平均 1.3 コピーで最も低いコピー数を示しました（図 2C）。以前の科学報告と同様に、我々のデータは、16 S rRNA 遺伝子のアンプリコン配列決定がアルツハイマー病における古細菌群集の存在量を過小評価していることを示唆しました [67、68]。 16 S rRNA 遺伝子配列に由来する微生物存在量をより適切に推定する 1 つの方法は、検出されたゲノムごとのコピー数によって結果を正規化することです [69]。しかし、実際の 16 S rRNA 遺伝子のコピー数は、多くの原核生物では不明です [34]。アンプリコン配列データを正規化するための現在のバイオインフォマティクスソリューションは、個々の遺伝子コピーの見かけの系統学的保存に依存しており、この仮定は系統学的距離が短い場合にのみ有効である可能性があります [70]。 16 S rRNA 遺伝子検出と組み合わせたゲノム分解メタゲノミクスは、この知識のギャップを埋めるのに役立つ可能性があります。

全体として、3 つの AD リアクターには異なる微生物群集が存在することがわかりました。多次元スケーリング (MDS; Bray-Curtis の非類似性尺度を使用して実装) により、3 つのバイオガスプラントにわたるマイクロバイオーム組成の分散が、個々のバイオガスの異なるサンプリングポイントにわたるマイクロバイオーム構造の分散よりも有意に大きいことが明らかになりました (PERMANOVA: p = 0.001)。植物。異なるBPのマイクロバイオームは時間の経過とともに特徴的な変化を示しましたが、いずれの場合も、これらの変化はその植物に特有のものでした（図3A）。この発見はユークリッド距離計算によって確認され、KBP と SZBP のマイクロバイオームは MWBP よりも互いに類似していることが示されました (図 3B)。過去の研究によれば、我々の分析では、KBPおよびSZBPマイクロバイオームには主にバクテロイディア、クロストリジウム、リムノコルディアが含まれているのに対し、MWBPマイクロバイオームにはバクテロイディア、アナエロリネア、放線菌が含まれていることが確認されました（図3D）[29、31、71]。したがって、ここで研究したバイオガス消化装置で見つかった主要な分類群を含む共通の微生物群集の景観が存在すると結論付けることができます [3、4]。

サンプルの多次元スケーリング。この尺度は、種の注釈レベル以上の微生物群集のブレイとカーティスの非類似性を示します。各シンボルは特定の BP サンプルに関連しています。 Oct、Jan、Apr、および Jul は、サンプルが収集された月を示します。 B BP サンプルのユークリッド距離。この尺度は、種の注釈レベル以上の微生物群集の非類似性を表します。 C 3 つの BP のドメインレベルでの nrMAG の分類学的分布 (CPM %)。 D nrMAG の分類学的分布。これは、採取した 12 個のサンプルすべて (つまり、各 BP 時点のペア) で最も豊富な分類群をクラス分類レベル (CPM % で表示) に分解したことを示しています。赤い名前は、最もアクティブなクラスの上位 15 に入っていないことを示します。 E さまざまなメタン生成経路に関与する古細菌微生物の全体的なメタトランスクリプトーム活性 (混合: 3 つのメタン生成経路すべてを使用できる nrMAG を示します)。 F 3 つの BP のドメイン分類レベルでの nrMAG の累積メタトランスクリプトーム活性 (TPM % で表示)。 G nrMAG のメタトランスクリプトーム活性。採取した 12 個のサンプルすべて (つまり、各 BP 時点のペア) に存在する最も活性な分類群をクラス分類レベル (TPM % で表示) に分解して示します。赤い名前は、最も多いクラスの上位 15 に入っていないことを示します。

メタゲノムおよびメタトランスクリプトームのデータ分布を使用して微生物の存在量と活動を調べると、明確なパターンが明らかになりました。相対存在量 (CPM %) に基づくと、見つかった上位 3 クラスはバクテロイディア、クロストリジウム、およびリムノコルジアでしたが、メタノサルシナの活性 (TPM%) はこれらのクラスのメンバーを上回りました。さらに、最も豊富な微生物クラスと比較して、最も活性な上位15のnrMAGの間でランクと分類学的組成に顕著な違いがあることも発見しました（図3DおよびG）。したがって、微生物の相対的な存在量は、相対的なメタトランスクリプトーム活性とは異なります。全体として、TPM% と CPM% の値を比較することで証明されるように、古細菌ドメインの代表者は存在量よりも高い活性を示しました (図 3C および F; 補足表 4 および 5)。この現象は、嫌気性バイオガス生成コミュニティでも観察されました [72]。

メタトランスクリプトミクスによって同定されたメタン生成古細菌は、3 つの工業規模バイオガスプラントすべてにわたって全体的な活性に有意な差を示さなかった（図 3E）。この観察は、異なるバイオガス施設間の条件やパラメータの変化にもかかわらず、メタン生成古細菌が同等の機能を示すことを示しています。この回復力は、消化槽内のメタン生成古細菌の多様性によるものである可能性があり、それがメタン生成コミュニティに冗長性をもたらす可能性がある [19、73、74、75]。

既知の系統特異的マーカー遺伝子セット (SCG) と MIMAG データに基づいて、高品質の nrMAG が 36%、中品質が 34%、および低品質の nrMAG が 30% 検出されました [76]。次に、再構成された nrMAG の分類学的割り当てにゲノム分類データベース (GTDB) が使用されました。これらの結果は、nrMAGを33の門に分類でき、そのうち3つは古細菌に属し、30は細菌に属していることを示しました（図4および補足表3）。

内部系統樹の背景色は、最初のリングに属する門をマークし、nrMAG 番号を示します。次の 2 つのリングのシンボルは、Biogas Microbiome (緑色) および GTDB (オレンジ) データベース内の特定の nrMAG の存在を表します。赤いシンボルは、高い完全性 (>90%)、低汚染 (<5%) を持ち、利用可能なデータベースで見つかっていない 7 つの nrMAG を示しています (古細菌: MAG_165_3、細菌: MAG_114_1、_18_1、29_1、77_1、87_1、および95_2)。紫色のシンボルはコア nrMAG を表します。外側のリングは、特定の BP で有意に蔓延している細菌を表します (レフサーを使用、p < 0.05)。

nrMAG は、fastANI ツールを利用して平均ヌクレオチド同一性 (ANI) を計算し、Biogas Microbiome データベースと比較されました [29]。このデータベースには、バイオガス消化装置で以前に発見された微生物ゲノムの包括的なセットが含まれています。我々は、再構成された高品質の nrMAG の 83% (完全性 >90%、n = 107) が Biogas Microbiome データベースに存在することを発見しました (ANI カットオフ: 95%)。高品質 nrMAG 全体の 7% (n = 107) と全 nrMAG (n = 297) の 2% を占める 7 つの高品質 nrMAG が、どちらの場合も最も近い代表と関連付けられなかったことは注目に値します。データベース。これらの nrMAG は、次の基準を満たしていないため、新規であるとみなされました。GTDB の参照半径 95% およびバイオガスマイクロバイオームの ANI ≧ 95% による種レベルの同定 (図 4 および補足表 3)。 3 つの高品質 nrMAG には 16 S rRNA 遺伝子配列も含まれることがわかりました (補足表 3)。さらに、7 つの推定新規 nrMAG は高い存在量と活性を示し、調査したマイクロバイオームにおいて、それぞれ、100 万あたりの総数 (CPM) の 3% と 100 万あたりの総転写物数 (TPM) の 5% を占めました。これらの nrMAG は、AD コミュニティの既知の参加者の領域に現在放出されていると考えられる微生物の暗黒物質のメンバーである可能性があります。

ゲノム中心のメタゲノミクスに基づくコアマイクロバイオーム解析を使用して、コア微生物群集の形成に役割を果たす可能性がある関連する可能性のある分類群を特定しました。したがって、このマクロ生態学的研究はメタトランスクリプトームデータによって裏付けられました（図5および補足図1）[37]。これらの分析により、nrMAG と AD パラメーターの関係、およびコアマイクロバイオームの形成における nrMAG の役割についての洞察が得られます。

ベン図は、nrMAG の総数と 3 つの BP 間で共有される nrMAG の数を示します (パーセンテージは示されています)。 B BP 間の細菌および古細菌の nrMAG の分布を示す三元プロット。ドットの色は、nrMAG が属する門を表します。ドットのサイズは、特定の nrMAG の総存在量 (つまり、すべての BP の累積 CPM 値) に比例します。

特定のバイオガスプラントにおける再構成されたnrMAGの分布の調査により、MWBPが調査された3つのシステムの中で最もユニークなマイクロバイオームを保有していることが明らかになりました。 MDS とユークリッド距離の計算によって証明されるように、KBP と SZBP は、いくぶん重複するマイクロバイオームを示しました。それにもかかわらず、3 つの消化装置すべてで 51 個の nrMAG が検出されました (図 5A)。同定されたコアnrMAGのほとんどは、よく知られた加水分解細菌（ファーミクテス属、バクテリオドータ属など）および多用途の代謝活性を持つメタン生成菌（ハロバクテリオタ属、メタノバクテリオタ属など）の代表的なものでした。これらの微生物は、バイオガスの生産性と持続可能なシステムのパフォーマンスを維持する上で重要な役割を果たしています[14、77]。一部の nrMAG はすべての消化装置に存在していましたが、その存在量は大きく異なりました。コア細菌の中では、ファーミクテス門、ファーミクテス A 門、およびバクテリオドータ門が SZBP と KBP の両方で見つかりましたが、Verrucomicrobiota 門、Armatimonadota 門、および Chloroflexota 門のメンバーが MWBP で優勢でした [6、29、66] (図 4 および 5B)。

nrMAG の共起分析を実行し、AD の化学パラメーターとの相関関係を計算しました (「統計分析」) (図 6)。共起ネットワーク分析により、メタン生成菌の大部分がバクテロイドタ門およびファーミクテス門と正の相関を示すことが実証されました。コア微生物の存在量に影響を与える主なパラメーターは、TAN、VOA、および TIC (ピアソンの rho > 0.5) でした。この観察に基づいて、AD 化学パラメーターとの特徴的な相関関係を示す 8 つのクラスターがプロットされました (図 6B)。 8 つのクラスターは 2 つのグループに分類でき、クラスター I ～ V の微生物は主な影響パラメーターと正の相関があり、クラスター VI ～ VIII の微生物はこれらのパラメーターと負の相関があります。また、ファーミクテス門、スピロヘトータ門、およびメタノバクテリオタ門に属するトップコア nrMAG が TAN、VOA、および TIC と正の相関がある一方、バクテロイド門門のメンバーも測定されたパラメーターの多くと相関していることもわかりました。最後に、C/N比は、トップコアnrMAGの中でファーミキューテスよりもバクテロイドータに対してより顕著な影響を示しました（図6B）。

コア nrMAG 間のピアソン相関。ロバスト性は、ネットワークに基づいて、調整された有意な p 値が 0.05 以下で、相関指数 (ピアソンの rho) が 0.7 を超えるという条件で計算されます。青い線は正の相関 (ピアソンの rho > 0.7) を表し、赤い線は負の相関 (ピアソンの rho < -0.7) を表します。アスタリスクの付いた門は、相関する微生物の中に存在しません。 B コア nrMAG と測定された AD 化学パラメーター間のピアソン相関。アスタリスクは有意な相関関係を表します (統計的に有意であるとみなされるのは次のとおりです: p < 0.05 (*)、p < 0.001 (**)、p < 0.0001 (***)、ns (有意差なし))。左側に示すクラドグラムと、TAN (全アンモニア態窒素)、VOA (揮発性有機酸)、TIC (全無機炭素)、TS (全固形分)、および C/N (炭素対窒素比) のデータを使用して、8 つのクラスターが作成されました。区別される。ここでは、これらを次のように色別に示します。クラスター I: グレー。クラスター II: 茶色。クラスターIII: 黄色。クラスター IV: 緑色。クラスター V: 紫。クラスター VI: 青。クラスター VII: オレンジ色。クラスター VIII: 濃い緑色。色付きのボックスは、nrMAG が属する特定の門を表します。赤い点は、最も加水分解している nrMAG を表します (n = 10)。

Methanoculleus 属 (ハロバクテリオタ門、水素栄養栄養性メタン生成菌を表す) は、コアマイクロバイオームの多様なコミュニティであることが判明しました。 TAN および VOA 濃度と正の相関を示す Methanoculleus の代表的な種は、KBP および SZBP で優勢でしたが、負の相関を持つ種は MWBP でより優勢でした。さらに、それらはバクテロイドタ門およびファーミクテス門のメンバーとも同時に発生しました。バクテロイドータ門およびファーミクテス門に属する微生物は、酸生成および酢酸生成を介して有機酸、アルコール、水素 (H2)、および二酸化炭素 (CO2) を生成することができ、これらの微生物の多くは酢酸栄養性および水素栄養性メタン生成菌と共生して存在します。水素栄養性メタン生成菌は、種間水素移動(IHT)を介して水素を消費し、CO2のメタンへの還元から得られるエネルギーを使用する[78]。水素を消費するメタン生成微生物は、水素を迅速に捕捉し、水素の分圧を低いレベルに維持することができます。これにより、水素を生成する酢酸生成細菌が有機化合物を酢酸塩、H2、CO2 に分解するための熱力学的に好ましい条件が得られます [14、79、80]。

2 種のメタン生成古細菌、Methanoculleus sp002497965 および Methanospirillum sp0125200015 (MAG_26_2 および MAG_103_2 と指定) がクラスター VI で発見され、クラスター II および III に属する Methanoculleus bourgensis および Methanoculleus 種 1 と負の相関を示しました。 MAG_26_2 と MAG_103_2 は MWBP マイクロバイオームに一般的に存在していました (図 4)。 Methanoculleus sp002497965 および Methanospirillum sp0125200015 はもともと AD マイクロバイオームで同定されましたが、我々の知る限り、これらの微生物に関する詳細な情報は依然として入手できません [81、82、83、84]。

本研究では、MAG_26_2 と MAG_103_2 はメタトランスクリプトミクスデータにより厳密な水素栄養栄養性メタン生成菌として分類されました。さらに、それらは TAN および VOA 濃度と負の相関関係を示しました (ピアソンのρ > -0.7)。ゲノムデータに基づくと、これらの古細菌は、ギ酸を電子供与体として使用して水素栄養性メタン生成を維持できるメタン生成菌のクラスに属します。通常、ギ酸はギ酸デヒドロゲナーゼによって CO2 に酸化され、さらにメタンに還元されます [85]。ここで、種間ギ酸移動（IFT）は微生物パートナー、すなわちSR-FBR-E99 sp002497965およびLD21 sp012519515（バクテロイド門門; MAG_72_3およびMAG_394_2由来）によって維持され、これらはMAG_26_2およびMAG_103_2と正の相関があった（図6A）。これらの MAG はバイオガス消化装置で以前に検出されており、その多用途な加水分解能力について説明されていました。炭水化物の利用とは別に、それらはギ酸を生成できるタンパク質とアミノ酸を分解する微生物です。それらはまた、ギ酸を利用するメタン生成菌とともに一貫して検出されました [86]。

存在する豊富なコアnrMAGの中で、明らかに酢酸栄養性メタン生成が可能な古細菌であるMethanothrix sp016706325（MAG_97_2）を同定しました（補足図1）。 MAG メタトランスクリプトームプロファイルに基づいて、主に酢酸栄養性メタン生成を実行し、直接種間電子移動 (DIET) を介して電子を取り込み、CO2 削減メタン生成を促進することができます。我々のデータは、それが非常に活性なアセチルCoAおよびF420生合成経路、ならびに活性な膜関連電子伝達（シトクロムC膜貫通タンパク質;補足表4）を有することを示している。以前の研究によると、メタノトリクス種は、酢酸塩のみに依存する場合とは対照的に、エネルギーの一部を DIET から得る場合に、より大きな活性を示します。しかし、それらの自然な共生パートナーに関する情報は限られている[87]。この古細菌（Methanospirillum sp0125200015）は、Methanoculleus sp002497965と密接に関連しています。この古細菌ネットワークは、前述のアミノ酸分解微生物と共生することが検出されています (図 6A)。これらの微生物は、活性な C 型シトクロムと線毛合成能力も持ち、どちらも DIET に不可欠です (MAG_72_3 および MAG_394_2; 補足表 5) [79、88、89、90]。代謝プロセス中に、還元フェレドキシンなどの還元等価物によって電子が生成され、運ばれることがあります。これらの電子伝達体を再酸化するために、ギ酸塩の生成により、エネルギーを節約するための電子処分ルートの使用が可能になる可能性がある[86]。したがって、Methanothrix_sp016706325 (MAG_97_2) は、電子処分ルートをサポートすることにより、バイオガス生成コミュニティにおいて重要な役割を果たしている可能性があります [91]。科学文献のデータと、デンマークの下水処理施設における嫌気性消化槽の包括的な分析に基づいて、メタノトリクスの代表者は、酢酸塩濃度と TAN 濃度の両方と負の相関関係を示しました [66、92、93]。

微生物群集と化学プロセスパラメーター間の相関関係は、農業バイオマスと廃水の AD 中の明確な電子伝達メカニズムを示唆しています。これらのプロセスは、VOA および TAN レベルと負の相関があり、電子処分ルートが豊富な場合に一般的に発生します。例えば、我々のデータと以前の研究は、タンパク質を加水分解し、アミノ酸を分解する微生物（GTDB分類法によれば、バクテロイド門およびバディンHA17科に属する（補足表3））が、ギ酸生産を維持するために水素栄養性メタン生成菌と共栄養関係を構築していることを示唆している。 DIET を介して電子を処分する [86]。

炭水化物活性酵素 (CAZyme) は、ポリマー炭水化物の分解に関与します。この律速段階を特徴付けるために、Pfam データベースと CAZy データベースに基づく結合データセットを使用して、さまざまな CAZyme および CAZyme 活性の兆候についてメタトランスクリプトームデータセットをクエリしました (図 7)。次に、同定された CAZyme を nrMAG にリンクしました (「メタゲノムのアセンブリとビニング」を参照)。

同定された CAZyme クラスと細菌門にわたるそれらの活性分布を示す Circos プロット。酵素は 5 つの CAZyme クラスに分類されました。グリコシルトランスフェラーゼ (GT) が最も高い活性を示し、次にグリコシド加水分解酵素 (GH)、炭水化物結合モジュール (CBM)、炭水化物エステラーゼ (CE)、および多糖リアーゼ (PL) が続きました。全体として、GH および GT 活性は、観察されたすべての微生物門で検出されました。 CBM 活性のほとんど (51% TPM) はファーミクテス属とバクテロイドータに関連していました。 B 広く分布している一般的なグリコシドヒドロラーゼ (GH) 酵素ファミリーのヒートマップ。 GH アクティビティは色付きのボックスで指定されます。 C 上位 30 の微生物種の炭水化物結合モジュール (CBM) およびグリコシド加水分解酵素 (GH) 酵素ファミリーの活性のヒートマップ (log10 TPM 値で表示)。赤い点は、コアコミュニティに存在する特定の nrMAG を示します (n = 10)。

同定された CAZyme の中で、グリコシド加水分解酵素 (GH) は、複合炭水化物の分解に関与する主要な酵素ファミリーです (図 7A) [94]。この多様な酵素ファミリーには、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチン、イヌリン、およびさまざまなオリゴ糖およびデンプン分解酵素が含まれます。メタトランスクリプトームデータによると、セルラーゼ、ヘミセルロース、およびデンプン分解酵素は、KBPおよびSZBPにおいて活性の上昇を示しました（図7B、C）。いくつかの違いの中でも、セルラーゼ (GH2 および GH3)、ヘミセルラーゼ (GH43 および GH18)、およびデンプン分解酵素 (GH97 および GH31) の活性はすべて、MWBP と比較して KBP および SZBP で有意に高かった (log2 FC: ≥2; p ≤ 0.05) (図 7B および補足表 5)。分類学的には、バクテロイド門門のメンバー（GHのTPMの46％を表す）、ファーミクテスGおよびファーミクテスA（それぞれGHの12％および7％のTPM）が、GH活性の主要な寄与者であった。これらの門は、多くのバイオガス生産コミュニティにおける主要な多糖類分解者であることがわかっています [77、95]。それにもかかわらず、我々のメタトランスクリプトームデータは、放線菌門（GH の TPM 8%）、クロロフレクソ門（GH の TPM 4%）、スピロヘトータ門（GH の TPM 5%）などの他の門のメンバーも複雑な炭水化物分解酵素を発現していることを示唆しました（図 1）。 7A）[29、38]。炭水化物結合モジュール（CBM）とGH活性を組み合わせた定量的評価により、上位30の加水分解nrMAGが複数の門に分布していることが明らかになりました（図7C）。

高活性な加水分解 nrMAG の中から 8 つのコア nrMAG が検出されました。これら 8 つは、上位の加水分解活性全体の約 35% を占めていました (図 7C)。 UBA1179_sp002340405 (MAG_187_1) と Fermentimonas sp019136875 (MAG_96_1) がクラスター I に属し、UBA1402 sp002305085 (MAG_105_3) とパルディバクター sp012519425 (MAG_151_3) がクラスター IV に属し、SR-FBR-E が判明しました。 99 sp009881065 (MAG_72_3) および W0P28-013 sp012837685 (MAG_251_2) ) クラスター VII に。 (図6Bおよび7C)。クラスター IV および I に属するトップコア加水分解装置のメンバーは、最も広範な相互作用を示しました (図 6A)。これらのクラスターは、IHT を介して直接的または間接的に関与しており、Methanoculleus bourgensis、Methanoculleus 種 1、Methanobacterium sp012838205、および Methanoculleus sp012797575 (ピアソンの rho 0.6 ～ 0.9) と正の関連性を示しました。ただし、このクラスターは、Methanospirillum sp0125200015、Methanothrix sp016706325、および Methanoculleus sp002497965 とも負の相関を示しました。 IFTおよびDIETが可能な後者の水素栄養性メタン生成菌および酢酸栄養性メタン生成菌は、クラスターVIIと同時発生した(ピアソンのrho < -0.6)。一般に、TAN、VOA、および TIC の濃度は、クラスター I および IV で nrMAG を加水分解する最も活性なコアと正の相関がありました (ピアソンの rho > 0.6)。ただし、クラスター VII に属する微生物には例外がありました。

メタン生成食物連鎖をさらに特徴付けるために、メタトランスクリプトームデータとKEGGデータベースからのデータを組み合わせることにより、nrMAGの機能分析を実行しました（図8）。 KEGG モジュールの分析により、メタン生成経路がすべての主要経路の中で最も活性であることが示されました (平均 = すべての KEGG 経路の TPM 35%)。これまでのメタゲノム研究では、メタン生成はバイオガス生産コミュニティにおける「希少なモジュール」であると考えられてきました [18、29、38] (図 8A)。メタゲノムデータに基づくとメタン生成は確かにまれなモジュールである一方、トランスクリプトームデータはその逆を示唆していることに留意することが重要である[95,96,97,98]。これを考慮すると、複雑な環境における微生物の生物学的活動を定量化するメタトランスクリプトーム分析は、メタゲノミクス研究よりも微生物の生命と群集内で発生する微生物の活動をより正確に表現します。

最もアクティブな KEGG モジュールのヒートマップ。メタトランスクリプトームデータ (TPM に表示) に基づく 12 サンプルすべての上位 30 KEGG モジュールを示します。 B KEGG モジュール機能データの主成分分析。各シンボルは、特定の BP サンプルペアに関連しています。 C 最も活動的な 5 つのメタン生成菌で特定された、大きく異なるメタン生成遺伝子。 DESeq2 によって計算された、統計的に有意であると考えられる差異が示されています (つまり、log2 FC > 2.0、p < 0.05)。ヒートマップは、さまざまな BP における各メタン生成菌の平均遺伝子活性を示します。空白は、提供されたメタン生成菌で有意な差がなかった遺伝子、または指定された遺伝子が所定の nrMAG に存在しないことを表します。

私たちは、ピルビン酸酸化、エンブデン・マイヤーホフ経路、およびペントース・リン酸経路を中心的な炭水化物代謝モジュールとして特定しました。これらの経路は、以前のメタゲノム研究では「コアモジュール」と呼ばれてきました[29、38]。加水分解によって生じる糖は、エンブデン・マイヤーホフ経路およびペントース・リン酸経路を介してピルビン酸に変換され、CO2 と電子が生成されます。さらに、アセチル CoA 経路、脂肪酸生合成、およびベータ酸化は、肥料を補充したリアクターで以前に観察されているように、炭素固定に関連する上位 30 の経路の中で活発に行われています [29]。この発見は、エネルギー、アミノ酸、補因子の生成に関連する多数の活性モジュールの同定によって裏付けられました。これらはすべて、適切に機能するバイオガス生成エコシステムに不可欠です。次に、KBPとSZBPは同様の微生物組成と機能プロファイルを共有しているが、MWBPのものは（KEGGモジュールに基づいて）明らかに異なるように見えることを発見しました（図8B）。

転写物レベルの発現パターンを評価するために、発現差分析を使用しました (「統計分析」を参照)。この高解像度分析を使用して、3 つの BP 間で 11,383 個の遺伝子の変化を検出しました (log2 FC > 2.0、p ≤ 0.05) (補足表 5)。 KBPおよびSZBPは、MWBPと比較して、これらよりも少ない発現差遺伝子(DEG)を含むことが示された(図8Bおよび補足図2)。 DEG の包括的な調査により、メタン生成に関与する 215 個の遺伝子が発見されました。メチル補酵素 M レダクターゼのアルファ、ベータ、およびガンマサブユニットの活性が最も大きな変化を示しました (log2 FC > 10、p < 0.0001)。さらに、F420非還元ヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロメタノプテリンデヒドロゲナーゼのイオン硫黄サブユニットなど、水素栄養性メタン生成に関係する遺伝子の発現には、実質的な差異が示されました（log2 FC > 5、p < 0.001）。アセチルCoAシンテターゼは、アセト栄養性メタン生成に関与する遺伝子間で発現の差異を示した(log2 FC > 5、p < 0.001) [99]。 KBP のさまざまな遺伝子活性の大部分は Methanothrix A harundinaceae D (MAG_5_1) に関連していましたが、MWBP の Methanothrix_sp016706325 (MAG_97_2) および Methanobacterium sp012838205、Methanoculleus sp12797575、および Methanosarcina 種 (MAG_669_3、_57_) に関連していました。 SZBP の 1、および _165_3) (図 1) 8C）。

複雑なバイオガス生成群集では、メタン生成古細菌はさまざまな代謝経路と遺伝子セットを利用して、エネルギーを獲得し、その活動を通じてメタンの豊富さを補う方法としてメタンを生成します。以前の研究によると、水素制限条件下では、メタノコッカス・マリパルディスは、F420非還元ヒドロゲナーゼやメチレンテトラヒドロメタノプテリンデヒドロゲナーゼなどの酵素をコードする遺伝子のmRNAレベルの上昇を示し、その結果、増殖速度が増加した[100]。 SZBP に豊富に存在する Methanoculleus sp12797575 (MAG_57_1) を用いた我々の研究でも同様の結果が観察されました。これらの酵素は、クラスター II に属するこの水素栄養性メタン生成菌において活性の上昇を示し、これは JAAZLA01 sp012799545 および UBA1361 sp002306335 加水分解酵素 nrMAG と同時発生しました (図 6A)。ギ酸デヒドロゲナーゼの発現上昇は、MAG_57_1がそのメタン生成活性を補う代替水素源としてギ酸を利用していることを示している(図8C)。この活性は、SZBP で一般的に見られる混合栄養性の Methanosarcina 種に匹敵します (これらはすべてのメタン生成経路を実行することができますが、GTDB および Biogas Microbiome データベースでは種レベルの代表的なものは特定されていません; MAG_165_3)。これは、メタン生成群集の代謝多様性が効率的なバイオガス生産にとって重要であるという以前の観察結果と一致している[74、75]。

この研究では、高品質の nrMAG (非冗長メタゲノム構築ゲノム) を再構築し、人工ニューラルネットワークのビニングワークフローを利用して、工業規模のバイオガスリアクターから採取された AD サンプルに対して正確なメタトランスクリプトーム解析を実施しました。 3 つの工業規模の BP は、十分に特徴付けられた異なる原料を使用して操業していましたが、観察期間中、それぞれのメタン収量に違いは観察されませんでした。 KBP および SZBP BP のマイクロバイオーム組成と機能レパートリーは、MWBP のどちらよりも互いに類似していました。複数の細菌門が主要な加水分解微生物として同定されました。コア微生物叢とTAN、VOA、TICなどの発酵パラメータとの間に有意な相関関係があることから、ADコア微生物群集の相互作用ネットワークがさまざまな化学操作パラメータの影響を受けることが示唆される。水素栄養性メタン生成菌（古細菌：Halobacteriota、Methanobacteriota）が優勢であり、細菌門の代表であるFirmicutesおよびBacteroidotaの存在と正の相関があり、それらは多様な種間移動を行っています。アルツハイマー病において水素栄養性メタン生成菌によって使用される独特の電子伝達機構は、農業バイオマスおよび廃水でも発見されている。主要な古細菌種 (Methanothrix sp016706325; MAG_97_2) が中核的なメタン生成群集で検出され、メタン生成微生物の戦略を形成する上で重要な役割を果たしている可能性があります。私たちの研究では、3つの工業規模のバイオガスプラントのメタン生成古細菌が、運転条件や測定されたパラメーターの違いにもかかわらず、同様の全体的な活動を維持していることがわかりました。消化槽内に多様なメタン生成古細菌が存在すると、冗長性と機能的安定性がもたらされ、コミュニティの回復力が強化される可能性があり、効率的なバイオガス生産を確保する上で代謝の多様性が重要な役割を果たしていることが強調されます。この発見は、BMP テストの測定結果とも一致していました。しかし、今回のケーススタディは、バイオガス生産群集のメンバー間の活動と種間の関係についての理解において、重要な知識のギャップが残っていることを裏付けています。これらのギャップは、ゲノム分解メタゲノム解析と、生息地固有のモデルなどの特定の機械学習アルゴリズムによって導かれる並行メタトランスクリプトミクスアプローチを組み合わせたフレームワークによって、少なくとも部分的に対処できます。

現在の研究中に生成および分析された生のメタゲノムおよびメタトランスクリプトーム配列は、アクセッション番号 PRJNA929705 で NCBI SRA に寄託されました。高品質 (完全 >90%、継続 <5%) nrMAG は、SAMN32989584 から SAMN32989690 までのアクセッション番号で NCBI SRA に寄託されています。この研究のために生成または分析された主なデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。ワークフローと R スクリプトは、合理的な要求に応じて最初の作成者から入手できます。

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Roland Wirth はバイオインフォマティクス分析を設計および実行し、原稿を執筆しました。 Teur Teur Sally Cheung と Zoltán Bagi は実験を実施し、分析測定を行いました。 Prateek Shetty はメタオミクス解析に貢献しました。 Kornél L. Kovács と Gergely Maróti は研究を計画し、原稿を書き、関連文献について議論しました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

この研究は、ハンガリー国立研究開発イノベーション基金 (NRDIF) プロジェクトによって部分的に支援されています。RW、BZ、および GM は、プロジェクト PD132145、FK142500、FK123902、FK123899、K143198、および ÚNKP-22-5-SZTE-537 からの支援を受けました。。この研究は、ハンガリー科学アカデミーのレンデュレットプログラム (GM) およびボリャイ奨学金 (WR) (LP2020-5/2020 および BO/00449/22)、およびセーチェーニプランプラス国立研究所プログラム (国立研究所) によっても支援されました。水科学と水の安全保障、RRF-2.3.1-21-2022-00008）。 BZ と KLK は、2020-3.1.2-ZFR-KVG-2020-00009 および 2019-2.1.13-TÉT_IN-2020-00016 からサポートを受けました。 ELKH Biological Research Center によって提供されるオープンアクセスの資金。

植物生物学研究所、生物学研究センター、セゲド、ハンガリー

ローランド・ヴィルト、プラティーク・シェティ、ジェルジェリー・マロティ

セゲド大学バイオテクノロジー学部（ハンガリー、セゲド）

ローランド・ヴィルト、ゾルタン・バギ、マーク・シュハイ、トゥール・トゥール・サリー・チャン、コルネル・L・コヴァチ

ハンガリー、バハ、公共サービス大学水科学学部

ゲルゲリー・マロティ

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転載と許可

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改訂日: 2023 年 5 月 23 日

受理日: 2023 年 5 月 26 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01448-3

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