高度な分析技術を使用したエルツグリフロジンの新規強制分解生成物の同定、単離、構造特性評価

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9472 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この研究では、2 型糖尿病患者の治療に使用されるエルツグリフロジンのストレス分解挙動が解明されました。分解は ICH ガイドラインに従って行われ、エルツグリフロジンは熱、光分解、中性、およびアルカリ加水分解条件において比較的安定です。ただし、酸加水分解および酸化加水分解ではかなりの分解が検出されました。分解生成物は、超高速液体クロマトグラフィー質量分析法によって同定され、セミ分取高速液体クロマトグラフィーによって単離され、高分解能質量分析法および核磁気共鳴分光法を使用して構造特性評価が行われました。酸分解では、分解生成物 1、2、3、および 4 である合計 4 つの分解生成物が同定および単離されました。一方、酸化条件では、分解生成物 5 が同定されました。形成された 5 つの分解生成物はすべて新規であり、これは以前には報告されていませんでした。これは、ハイフン付き分析手法を使用して、5 つすべての分解生成物の完全な構造特性を文書化した初めての文書です。本研究では、分解生成物の構造を具体的に確認するために、高分解能質量分光法および核磁気共鳴分光法が使用されました。現在の方法は、将来的に実行時間が短い分解生成物を特定するためにも使用されます。

2 型糖尿病治療薬では、エルツグリフロジンが阻害剤として使用されます 1、2、3。単独の薬として利用でき、シタグリプチンおよび塩酸メトホルミンと組み合わせて使用できます。市場で入手可能な文献は、分析技術および生物分析技術の開発の検証を明らかにしており、この薬剤（エルツグリフロジン）およびシタグリプチンとメトホルミンの混合物を使用して研究が可能であることを示唆する安定性を示しています。エルトゥグリフロジン（商品名ステグラトロ）という薬は、2 型糖尿病の治療に使用されます。米国食品医薬品局は、米国での単独療法としての使用、およびシタグリプチンまたはメトホルミンとの固定用量の組み合わせでの使用を認可しました4。 2018年3月にヨーロッパで単剤療法または併用療法としての使用が承認されました。エルツグリフロジンはグリフロジンとして知られる医薬品ファミリーに属し、SGLT2阻害剤です。セグロメットはメトホルミンと組み合わせて販売され、ステグルジャンはシタグリプチンと組み合わせて提供されます。

エルツグリフロジンは、ステグラトロという商品名で販売されています。分子式はC22H25ClO7（分子量：436.13）、化学名は5-(4-クロロ-3-(4-エトキシベンジル)フェニル)-1-(ヒドロキシメチル)-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]です。 ]オクタン-2,3,4-トリオール。エルツグリフロジンはピログルタミン酸塩の形であり、白色の非吸湿性の結晶性粉末として現れます。アセトンとエタノールに溶け、アセトニトリルと酢酸エチルにわずかに溶け、水にしか溶けにくい。図 1 は、エルツグリフロジンとその分解生成物の構造をまとめたものです。文献を精査したところ、エルツグリフロジンとメトホルミンおよびシタグリプチンを組み合わせた独自の分析に関する出版物はほとんどないことがわかりました。エルツグリフロジン戦略の開発は、メトホルミン RP-HPLC5、6、7、8、9、10、11、シタグリプチン 12、13、14、15、16、17、18 との組み合わせ、メトホルミンとシタグリプチンの両方との組み合わせについて報告されています 19。 LC-MS/MS アプローチを利用したいくつかの生物分析戦略は、血漿中のシタグリプチンおよびエルツグリフロジンを検出するために報告されています 20,21。しかし、これまで、エルツグリフロジン分解生成物とその特性を説明するために利用できる文献はありませんでした。分解生成物の NMR、高分解能質量分析、および IR 研究を提供する文献はありません。本研究は、エルツグリフロジンの 5 つの分解生成物すべての詳細な構造特性を説明します。したがって、現在の研究では、ERG とその 5 つの分解生成物に対する UHPLC-MS メソッドのクロマトグラフィー法の開発が含まれており、HRMS/MS、IR、 NMR (1D、2D) 実験。

エルツグリフロジンとその分解生成物の構造。

エルツグリフロジンの有効医薬品ギフトサンプルは、ハイデラバードの大手製薬会社から入手しました。研究に使用された試薬と化学物質は、インドのハネウェルリサーチケミカルズから購入した水酸化ナトリウム、塩酸、30% 過酸化水素 (分析グレード) ギ酸 (LCMS グレード)、アセトニトリル (HPLC グレード) でした。分析に使用した水は、オランダ、アムステルダムのミリポアのミリ Q 装置からのものでした。 Cambridge Isotope Laboratories, Inc. のジメチルスルホキシド-d6 (NMR グレード) D、99.9% + 0.03% v/v。

現在の研究に使用されている分析機器およびサポートされているソフトウェアは、ウォーターズシングル四重極検出器と maslynx 4.2 ソフトウェアを備えた Acquity UHPLC フロントエンドの UHPLC-MS 機器です。 ESI イオン源および x-calibur ソフトウェアを備えた Dionex ultimate 3000 LC フロントエンド q-exactive orbitrap MS を備えた Thermo の HRMS 機器。 Waters 製バイナリモジュール 2545、検出器 2489、およびクロムスコープ 2.1 ソフトウェアを備えたオートサンプラー 2707 の精製機器。 Bruker Avance neo 400 MHz の NMR 装置 (topspin 4.09 ソフトウェアを搭載)。 Sartorius-SQP-F の分析天びん、島津 ir-afinity-1S の赤外分光分析装置およびラボソリューションソフトウェア。

液体クロマトグラフィーの分解能は、Acquity UHPLC およびフォトダイオードアレイ検出器 (PDA) フロントエンドを接続した Waters 製の単一四重極質量検出器 (SQD2) で達成されました。 ESI (エレクトロスプレーイオン化) 源とウォーターズの単一四重極質量分析計による負と正の二重極性を質量分析に利用しました。MS の最適化は、100 ～ 1200 ダルトン (Da) のスキャンモードを使用して行われました。脱溶媒和温度は 350 °C に維持されました。脱溶媒和の流量には 700 L h-1 のガスを設定し、コーンガスの流量は 60 L h-1 に設定しました。液体クロマトグラフィー質量分析装置は、MassLynx 4.1 アプリケーションマネージャーを使用して操作されました。サンプルは 10 °C の温度に維持され、4.0 分の短いクロマトグラフィー実行時間および 0.5 μL の注入量で実行されました。

適切で信頼性が高く、再現性のある方法を追求するため、異なるカラムを使用する異なるバッファーをスクリーニングして、解像度を最適化しました。当初、メソッドの開発は、トリフルオロ酢酸、ギ酸、重炭酸アンモニウム緩衝液、およびアキューティフェニル、C18、CSH C18 などのさまざまなカラムを使用して行われました。豊富な試験中、acquity BEH C18 を含む 0.1% ギ酸緩衝液は肯定的で有望な結果を示しましたが、残りの試験では分解能が低いか分解能が低かったです。さらに、acquity BEH カラムについて、さまざまな流量とグラジエント条件で広範な試験が行われました。すべての分解生成物と API の最適な分離は、Waters Acquity UPLC BEH C18 カラム (50 × 2.1 mm、1.7 μm) カラムで達成されました。移動相には、水中 0.1% ギ酸およびアセトニトリル中 0.1% ギ酸を含む移動相 A および B が含まれていました。分離はグラジエントプログラムを使用して達成されました。時間 (分)/B 濃度 (%): 0/3、0.5/3、2.5/98、3.5/98、3.6/03、4/03、流速 0.4 mL min-1カラム温度は 35 °C です。フォトダイオードアレイ (PDA) 検出器を使用して溶離液を監視しました。希釈剤は水とアセトニトリルの 1:1 (v/v) 混合物で使用します。この条件では、6 つのピークすべてが良好なピーク形状と分解能で分離されました。最終的なメソッド開発トレースを図 2 に示し、分解トレースを図 3 に示します。

acquity BEH C18 カラムにおけるエルツグリフロジンとその分解生成物のメソッド開発。

エルツグリフロジン分解経路の酸加水分解 (A) および酸化的加水分解 (B)。

サンプルは、Thermo Q Exactive orbitrap MS を備えた ESI ソースを使用して分析されました。フロントエンドとして PDA 検出器を備えた UHPLC Dionex Ultimate 3000。使用した機器のソースパラメータは、スプレー電圧: 3.5 kV。補助ガス流量: 14; キャピラリー温度: 270 °C; スイープガス流量: 3; 補助ガスヒーター温度: 440 °C。シースガス流量: 53。質量データは、xcalibur ソフトウェアを使用して取得しました。レセルピン (単一同位体質量: 608.2734 Da) を標準として使用して、質量分析装置の精度をチェックしました。クロマトグラフィー条件は UHPLC-MS と同様でした。すべての分解生成物の HRMS データを図 4 に示します。すべての分解生成物の HRMS-MS 分析で得られた質量断片化データを表 1 に示します。

エルツグリフロジンおよびその分解生成物の HRMS および HRMS-MS データ。

Waters セミ分取 HPLC 2489 デュアル UV 検出器、2545 ポンプモジュール、および自動フラクションコレクター III を備えた 2707 サンプルマネージャー。全体の装置は ChromScope-2.1 ソフトウェアで制御され、社内で梱包された Luna C18 150 × 25 mm、5 μm が分解生成物の単離に使用されました。単離された純粋な画分はすべて、Lyofreeze 凍結乾燥機を使用して凍結乾燥されました。

酸性および過酸化物環境では劣化が見られました。酸加水分解されたサンプルを中和するために、(NH4)2CO3 の飽和溶液が利用され、得られた溶液は凍結乾燥を使用して固化されました。過酸化物溶液を希釈した後、蒸発させて遊離固体を得た。分取 HPLC 精製の場合、同一のサンプルを少量の移動相に溶解しました。

エルツグリフロジンおよび分解生成物の 1H、13C、および 2D NMR スペクトルは、感度 225 の Z 勾配のシムシステムを備えた 5 mm 広帯域観察プローブ (BBO) を備えた Bruker Avance Neo 400 MHz NMR 装置で DMSO-d6 溶媒中で分析されました。 :1 および 480:1。ゼロ ppm の TMS (テトラメチルシラン) シグナルを 1H の基準として使用し、13C については DMSO-d6 の 39.5 ppm セプテットシグナルを使用しました。

島津 IR-Afinity-1S モデルとラボソリューションソフトウェアを使用して、化合物に存在するアルコール、ケトン、クロロケトンなどの官能基を認識しました。分散媒としてＫＢｒを用いてサンプルペレットを調製した。

ICH 安定性ガイドライン 22、23、24、25、26 に従って、さまざまな強制分解パラメーター、つまり、熱、光分解酸化、中性、酸、および塩基の加水分解条件が使用されました。 ERG の強制分解研究は、安定性研究に関する ICH ガイドラインに記載されているように実施されました。 ERG 標準溶液 (10 mg mL-1)。1 ミリリットルを 10 mL メスフラスコに移し、30% 過酸化水素水で標線まで希釈しました。溶液を室温で撹拌した。１ミリリットルの溶液を採取し、ＡＣＮ水（１：１ｖ／ｖ）で１０ｍＬに調整した。最終濃度 100 μg mL-1 を得るために、分解挙動を取得するためにさらなる研究が行われました。光分解のために、25 mg の ERG サンプルを UV チャンバー内で 254 nm UV 光に 48 時間曝露しました。熱分解の場合、25 mg の ERG サンプルを 100 °C で 48 時間保持し、分解挙動を観察するためのさらなる研究に使用しました。

中性、酸および塩基の加水分解研究のために、ERG の標準原液 (10 mg mL-1) を ACN と水 (1:1 v/v) で調製しました。 1 mL の ERG 標準原液を 10 mL メスフラスコに移しました。次に、中性分解には水、アルカリ分解には 1 N NaOH、酸性分解には 1 N HCl を使用してマークまで補充します (最初は、同じ手順を 0.1 N NaOH と 0.1 N HCl で実行しました。ただし、大幅な分解は観察されませんでした)。そのため、酸と塩基の強度は 1 N に増加しました)。溶液を６０℃の温度で撹拌し続けた。溶液１ミリリットルを採取し、中和し、１０ｍＬメスフラスコに移した。次に、水を加えて体積を調整し、最終濃度 100 μg mL-1 を得ました。分解挙動を把握するためにさらなる研究が行われました。

ERG 化合物は、中性、塩基性加水分解、光分解、熱条件下で非常に安定しており、いかなる分解も示さなかったことから、上記条件下での ERG の安定性が確認されました。この薬物は酸加水分解および過酸化物条件に対して不安定であることが判明した。その結果、過酸化物（30% H2O2、室温で撹拌しながら最長 48 時間）、酸（1 N HCl 還流、撹拌温度 60 °C で最長 48 時間）の両方で約 15 ～ 20% の分解が観察されました。そして条件。詳細な分解条件と結果を表 2 に示し、酸加水分解条件と過酸化物条件の分解クロマトグラムを図 3 に示します。酸加水分解条件では、4 つの DP (DP-1、DP-2、DP-3、および DP) が形成されました。 -4)、一方、酸化条件では、1 つの分解生成物 (DP-5) が形成されました。すべてのDPの確認された構造を図1に示します。

分解不純物の形成は以下の通りであり、DP1の形成では、化合物1と同様に最初の酸媒介プロトン化ホルムアルデヒドのオルト位への求電子置換、その後のアセトニトリルとのリッター化学によりDP1が得られた。 Journal of Analytical and Applied Pyroloss、113 (2015) 621–62927 の文献によると、標的分子の糖部分は熱酸条件下で徐々に分解してホルムアルデヒドを形成します。これは、（原稿に記載されているように）酸性媒体下で標的分子と反応すると、3 の形成を促進します。これは次にアセトニトリル（溶解目的の溶媒として使用）と反応して、リッター化学によって DP-1 を形成します。

DP2 の形成、DP2 の形成について提案されている分解経路は、ブレンステッド酸性条件下での文献 (Chemical Engineering Journal 307, 2017, 877–883)28 に基づいています。

Journal of Analytical and Applied Pyrolossy, 113 (2015) 621–629 の文献によると、DP3/DP4 の形成では、標的分子の糖部分が徐々に分解されて、さまざまな割合でホルムアルデヒド/アセトアルデヒドと酢酸が形成されます 29,30。形成された酢酸は、既存の熱酸条件下での DP2 のエステル化に関与します。同様に、遊離ヒドロキシメチル基は SN2 メカニズムを介して塩素化されます。したがって、酸はヒドロキシル基をプロトン化し、続いて塩化物によって置換されて、対応するDP4を形成します。

DP5 の形成 DP5 の形成について提案されているメカニズムは、アリールエトキシ基の酸化的開裂を介して、対応するフェノール、すなわち DP5 を形成することです。

質量分析 (UHPLC-MS) を使用して、個々のサンプルを分析して、すべてのストレス研究の結果を決定しました。すべての分解物は時間の経過とともに形成され、各制約からの研究条件は実験セクションで概説されます。 5 つの実質的な分解生成物が、UHPLC-MS、分取 HPLC、HRMS、2D-NMR、および FTIR 技術によって同定、単離、特性評価されました。これらの分解生成物のほとんどは、API の 6 員炭水化物環が 5 員フラン環に再配置されることによって形成されます。

過酸化物および酸ストレス条件下では、分解の結果として 5% 以上のかなりの割合で分解生成物が形成されることが観察されました。 Luna C18 カラム (150 mm × 25 mm、5 μm) およびアセトニトリル、0.1% ギ酸水溶液を精製用の移動相として使用しました。粗サンプル溶液を連続して注入し、UV 応答に基づいて分画収集を行い、その後 LC-MS で質量を確認しました。さまざまな分解生成物の画分を別々に収集し、凍結乾燥して遊離固体を得た。

エルツグリフロジン API の構造情報を取得するために、すべての分析データが参照目的で記録されました。 ESI-MS ポジティブモード条件下では、[M + H]+ イオンとアンモニア付加物 [M + H + NH3]+ イオンがそれぞれ 437.1350 と 454.1617 として検出され、エルツグリフロジンの分子式が C22H25ClO7 であることが確認されました。エルツグリフロジンの確認データは、HRMS、HRMS/MS スペクトル (図 4、表 1)、IR (表 4) に記載されています。 HRMS / MSが提案するERGのプロトン化フラグメンテーションイオンの暫定的なメカニズムを補足データ図S1に示します。酸性加水分解条件および過酸化物条件におけるエルツグリフロジンの分解挙動を説明するために提案された構造機構を図5に示し、2D-NMRを使用したERGの構造立体配座を図1および2に示します。 6とS2。 ERG の構造立体配座は HRMS と 2D-NMR によって行われます。他のすべての分解生成物は、この構造解明データの比較に基づいて特徴付けられます。

酸性加水分解条件および過酸化物条件におけるエルツグリフロジンの分解挙動の提案。

ERG、DP-1、DP-2 の NMR スペクトルの例。

エルツグリフロジンを酸で処理すると、分解生成物-1 (DP-1) が生成しました。この分解生成物は単離され、図 4 に示す分子式 C25H30ClN5O8 の HRMS でその質量が [M + H]+ 508.1724 (-1.7675 ppm 誤差) であることが確認されました。HRMS スペクトルにより、分子内に 1 つの塩素原子が存在することが確認されます。構造。分解生成物の完全な構造は、NMR および HRMS 研究によって決定されました。サンプルは DMSO-d6 溶媒中で調製され、NMR 分析に供されました。最初に 1H NMR および D2O 交換実験を記録しました。 1H と D2O データを比較すると、化合物中に 5 つの交換可能なプロトンが存在し、芳香族領域には 1,4 二置換環パターンが存在せず、1,2,4 三置換環パターンが存在することが確認されます。 API 化合物との主な違いは、二級アミド (H32)、メチレンプロトン (H31)、およびアセチル基 (H34) の存在です。 1H NMR では、合計 30 個のプロトンが存在し、二級アミドは 8.08 ppm にあり、芳香族プロトンは 6.0 ～ 8.0 ppm の間に示されました。一次および二次アルコール性プロトンは 4.5 ～ 5.5 ppm で、脂肪族プロトンは 1.0 ～ 4.5 ppm で共鳴します。 N-メチレンプロトンは 4.15 ppm で示され、アセチルプロトンは 1.85 ppm で示されます。 O-メチレンは 4.00 ppm、芳香族メチレンプロトンは 3.97 ppm です。 13C NMR では、合計 25 個の炭素が示されました。最も低磁場炭素はアセトアミドカルボニルであり、169.26 ppm で示され、次に O-エチル基が結合した四級炭素が 154.36 ppm で示されます。残りの芳香族炭素は 100 ～ 140 ppm の間であり、脂肪族炭素は 10 ～ 90 ppm で示されていました。 HSQC 実験では、H31 メチレンプロトン結合炭素が 37.16 ppm で示され、N-アセチルプロトン結合炭素が 22.47 ppm で示されることが確認されました。 gDQ-COSY 実験では、H31 プロトンは H32 プロトンと相関を示しました。 1H-15N HSQC 実験では、H32 プロトンはアミド性 NH プロトンであることが確認され、その窒素価は 115 ppm を示しています。 1H-13C HMBC 実験では、H31、H32、および H34 プロトンは C33 炭素への接続性を示し、H31 プロトンは C9、C10、および C11 炭素への接続性を示しました。 1D および 2D NMR データの重要な情報はすべて、1,4 二置換環がベンジルアセトアミドに変換されたことを確認します。最後に、N-(5-(2-クロロ-5-(2,3,4-トリヒドロキシ-1-(ヒドロキシメチル)-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタン-5-イル)ベンジル)-を形成した。 2-エトキシベンジル)アセトアミドおよび2D NMRスペクトルを図1および2に示しました。 6とS3。化学シフトを表 3 に示し、提案された分解メカニズムを図 5 に示します。

さらに、FT-IRスペクトルにおける3415cm-1の伸縮周波数はNHおよびOH基の存在を特定し、1645cm-1の伸縮周波数はアミドケト基の存在を指示する。 811 cm-1 の伸縮周波数により、C-Cl 基が存在します。表 4 に示すように、重要な FT-IR スペクトルにより、ケト、アミド、アルコール、および塩素官能基の存在が確認されました。DP-1 については、HRMS/MS スペクトルと、プロトン化されたフラグメンテーションイオンについて提案された暫定的なメカニズムが図 1 および 2 に示されています。 4とS1。

DP-2 化合物は、ERG 化合物の酸加水分解で形成されました。構造情報を取得するために、DP-2 HRMS 分析を実行したところ、図 4 に示す計算分子式 C21H19ClO4 の誤差 2.0463 ppm で、プロトン化分子として 371.1037 [M + H]+ が得られました。HRMS スペクトルにより、構造内に 1 つの塩素原子があり、分解生成物の質量は親エルツグリフロジンより 66 単位少ないです。分解生成物の詳細な構造を取得するために、1D および 2D NMR 実験が行われました。 DP-2 の 1H NMR データは、API 化合物との極端な違いを示しました。ここでは二環式環プロトンは見えず、5.56 ppm の一級アルコールプロトンが三重項として認識され、D2O 交換で交換されました。メチレンプロトンは 4.51 ppm で二重線として示され、フラン環プロトンは 6.59 および 7.28 ppm で J 値 3.2Hz で示されます。芳香族領域では 1,4 二置換環、1,2,4 の三置換パターンプロトンが親化合物と同様に 6 ～ 8 ppm で存在し、脂肪族領域では O-エトキシプロトン、メチレンプロトンが 1.0 ～ 4.5 ppm の領域で示されました。 13C NMR では、対称性がある C9 ～ C13 および C10 ～ C12 炭素がそれぞれ 1 つのシグナルとして表示されるため、合計 19 個の炭素が示されました。ほとんどの低磁場炭素はケトンであり、180.11 ppm で共鳴します。フラン環の四級炭素は 150.15、161.7 ppm で示され、O-エトキシ結合アリール炭素は 157.05 ppm で示されます。残りのアリール炭素は 110 ～ 140 ppm で表示されます。脂肪族領域では 4 個の炭素が示されており、主要なメチレン炭素は 55.94 ppm であり、HSQC 実験でも同様であることが確認されました。 HSQC 実験からのその他の重要な情報は、フラン環のプロトン化炭素の特定です。 COSY実験より、一級アルコールプロトンH26はH25メチレンプロトンと相関を示し、フラン環プロトンH21、H22は相互に相関を示しました。 g-HMBC 実験から、H25 プロトンは C22 および C23 炭素への接続性を示し、H1、H3 プロトンは C18 炭素への接続性を示すことが確認されています。ＮＭＲデータに基づいて、二環式環が再配置され、図１および図２に示される構造のような２，５環置換フラン環を形成していると結論付けられた。 6およびS4を生成し、(4-クロロ-3-(4-エトキシベンジル)フェニル)(5-(ヒドロキシメチル)フラン-2-イル)メタノンを形成した。化学シフトを表 3 に示し、提案される分解メカニズムを図 5 に示します。

さらに、FTIRスペクトルにおける3481cm-1の伸縮周波数はOH基の存在を確認し、1637cm-1の伸縮周波数はケト基の存在を特定する。 756 cm-1 の伸縮周波数は、C-Cl 基の存在を示しています。表 4 に示すように、FT-IR の有意な周波数により、アルコール、ケト、およびクロロ官能基の存在が確認されました。DP-2 については、HRMS/MS スペクトルと、プロトン化フラグメンテーションイオンについて提案された暫定的なメカニズムが図 1 および 2 に示されています。 4とS1。

ERG 化合物の酸加水分解により DP-3 化合物が得られました。 DP-3 の構造情報を取得するために、HRMS 分析を実行し、プロトン化分子 [M + H]+ が 413.1139 (-2.8246 ppm 誤差) として観察されました。これは、図 4 に示す計算された分子式 C23H21ClO5 を確認します。分解生成物の質量ERG よりも 24 ユニット少ないため、正確な構造を知ることができます。さらに、NMR 実験も記録されました。 DP-3 化合物 1D NMR は DP-2 とほぼ同様ですが、アルコール性プロトンの代わりにアセチル基が見られるものの、違いはほとんど観察されません。 1H NMR では、合計 21 個のプロトンが存在し、芳香族領域からの 9 個のプロトンとフラン環プロトンが J = 3.6Hz で 6.79 および 7.32 ppm に示されます。脂肪族領域では、合計 12 個のプロトンが存在し、3 つのメチレン基が 3.5 ～ 5.5 ppm の間に示され、アセチル基プロトンが 2.07 ppm に示されました。 13C NMR では炭素数は 21 で、そのうち 16 個は芳香族炭素、5 個は脂肪族領域からの炭素です。最も低磁場の炭素は 180.22 ppm のケトンで、次に O-アセチルが 169.86 ppm、O-エトキシ結合アリール炭素が 157.05 ppm です。フラン環四級炭素は 150.92 および 154.92 ppm、プロトン化炭素は 122.12 および 112.85 ppm、残りの炭素は 110 ～ 140 ppm で示され、脂肪族炭素は 10 ～ 65 ppm で示されました。総炭素数からプロトン化炭素を特定するために、HSQC 実験を行ったところ、O-メチレン炭素 C25 が 57.47 ppm、C15 が 62.86 ppm、フラン環プロトン化炭素が 122.12 および 112.85 ppm であることが確認されました。 COSY 実験 H21、H22 のプロトンは相関を示します。 2J および 3J 相関を確認するには、DP-3 化合物 HMBC 実験が非常に役に立ちました。ここで重要な相関は、H25、H28 プロトンが C27 炭素への接続性を示し、H25 が C22 への接続性を示し、C23 炭素もまた、H1、H3 プロトンが C18 への接続性を示しました。炭素はこれらの残りの接続とともに構造に適合します。分解生成物-3の構造は(5-(4-クロロ-3-(4-エトキシベンジル)ベンゾイル)フラン-2-イル)メチルアセテートであり、2D NMRスペクトルを図1および2に示した。 7とS5。化学シフトを表 3 に示し、提案された分解メカニズムを図 5 に示します。

DP-3、DP-4、および DP-5 の NMR スペクトルの例。

FT-IRおよび1744および1645cm-1の伸縮周波数で行われたさらなる確認は、ケト基の存在を示し、1349、1039cm-1のシグナルはC-O基の存在を確認する。 3400 ～ 3000 cm-1 の領域に信号がないことは、OH および NH プロトンが構造内に存在しないことを裏付けます。 756 cm-1 の伸縮周波数は、C-Cl 基の存在を示しています。表 4 に示すように、顕著な FT-IR スペクトルにより、ケトおよびクロロ官能基の存在が確認されました。DP-3 の HRMS/MS スペクトルおよびプロトン化フラグメント化イオンの提案された暫定メカニズムを図 1 および 2 に示します。 4とS1。

DP-4 は ERG を酸で処理する結果となりました。分離後、その質量を知るために HRMS を記録しました。 DP-4 の構造情報については、HRMS 分析を実行し、図 4 に示す分子式 C21H18Cl2O3 のプロトン化分子 [M + H]+ 389.0694 (誤差 - 2.9529 ppm) と、塩素原子を2つ持つ化合物。親の ERG 化合物と比較して、ユニットが 48 少ないです。 NMR 研究により、DP-4 の正確な構造が推定されました。サンプルは DMSO-d6 溶媒で調製され、DP-4 の構造を調べるために必要な 1D および 2D NMR 分析が行われました。 1H NMR データでは 18 個のプロトンが示され、DP-2 と DP-4 の 1H NMR データの間にわずかな違いが観察されました。つまり、DP-4 ではアルコール性プロトンが欠落しており、H25 メチレンは 4.93 ppm で一重項として示されています。フラン環プロトンは、J = 3.6Hz で 6.82 および 7.31 ppm で示されました。 2 つの強い二重線 H9、H13、および H10、H12 は 7.15、6.86 ppm で示され、H1、H2、および H3 プロトンは 7.5 ～ 7.9 ppm の間で、脂肪族プロトンは 1 ～ 5 ppm の間で示されます。 13C NMR では炭素数は 19 で、これは 6 つのシグナルが観察されるのではなく、1,4-二置換環の対称性によるものです。ほとんどの低磁場炭素はケトンであり、180.21 ppm で共鳴し、残りの炭素は 110 ～ 160 ppm で示されます。脂肪族領域では 4 つの炭素が示されており、C25 の主要なメチレン炭素は 36.88 ppm、O-エトキシ炭素は 14.63 および 62.86 ppm、C7 のメチレン炭素は 37.37 ppm です。 HSQC 実験により、プロトン化炭素、フラン環プロトン化炭素シフトが 122.26 および 112.62 ppm で示されることが検証されました。 HMBC 実験では、H25 プロトンにおける 2 つの重要な接続性が観察され、C23 炭素との 2J 相関および C22 炭素との 3J 相関が示されました。 2 番目に重要な接続性は、C18 炭素の接続性を示す H1、H3 プロトンです。 NMR データのすべての重要な情報は、二環式環が再配置され、1,5 置換フラン環が形成されたことを確認します。その結果、(4-クロロ-3-(4-エトキシベンジル)フェニル)(5-(クロロメチル)フラン-2-イル)メタノンを形成する構造と2D NMRスペクトルを図1〜3に示した。 7とS6。化学シフトを表 3 に示し、提案された分解メカニズムを図 5 に示します。

FTIR スペクトルはシグナルの存在を示します。1649 cm-1 はケト基の存在を示し、1305 および 1246 cm-1 のシグナルは C-O 基の存在を示します。 841,703 cm-1 の伸縮周波数は、C-Cl 基の存在を示しています。 3400 ～ 3000 cm-1 の領域に単一のイオンは存在せず、構造内に OH および NH プロトンが存在しないことが確認されます。スペクトルの FT-IR シグナルは、表 4 に示すように、クロロ官能基とケト官能基を含む構造に一致します。DP-4 の HRMS/MS スペクトルと、プロトン化フラグメンテーションイオンについて提案されている暫定的なメカニズムを図 1 と 2 に示します。 4とS1。

分解生成物-5 は、API 化合物を過酸化水素で処理することによって形成されました。 DP-5 の構造情報については、HRMS 分析を実行し、図 4 に示す分子式 C20H21ClO7 に対して、誤差が -2.9086 ppm の 409.1037 のプロトン化分子 [M + H]+ が観察されました。質量データから、28 ユニットであることがわかります。親 API 化合物よりも小さく、構造内に 1 つの塩素原子がありました。 NMR 研究により、DP-5 の完全な特性評価が行われました。 DMSO-d6 に溶解したサンプルに対する必須の NMR 実験を記録しました。 NMR 1H と D2O の主な実験。1H-NMR データでは 21 個のプロトンが示され、D2O 交換実験では 5 個のプロトンが交換され、16 個のプロトンが示されました。したがって、化合物中に 5 つの不安定なプロトンが存在することが確認されました。 DP-5 化合物と親化合物との主な違いは、O-エトキシ基が欠落していることと、9.24 ppm でフェノール性 OH プロトンが存在することです。残りの 4 つの不安定なプロトンは 4.5 ～ 5.5 ppm (1° ～ 2° アルコール性) を示します。芳香族領域では、1,4 二置換環プロトンは 6.66 および 6.97 ppm、クロロ置換環プロトンは 7.1 ～ 7.5 ppm、脂肪族メチンおよびメチレンプロトンは 3 ～ 4 ppm を示します。 13C NMR では、脂肪族領域では 7 個の炭素が示され、芳香族領域では 11 個のシグナルが示されました。より多くの脱シールド炭素はフェノール性 OH に位置する第 4 級炭素であり、残りの芳香族シグナルは 100 ～ 140 ppm で示されました。脂肪族領域では、O 結合メチレンおよびメチン炭素は 55 ～ 90 ppm の間で示され、芳香族メチレン炭素は 37.70 ppm です。 HSQC実験では、メチレンとメチン炭素のシフトが確認されました。 COSY実験では、H24陽子はH19との結合性を示し、H23はH20との結合を示し、H22陽子はH21陽子との結合を示し、H28はH25陽子との相関を示した。これらの接続性は、メチンおよびメチレンのプロトンを識別するのに役立ちます。 HMBC 実験では、重要な 3J 相関はほとんど観察されず、H1、H3、および H27 プロトンは C16 炭素への結合を示しています。また、H7 プロトンは C3、C5 および C9、C13 への 3J 結合を示します。 C4、C8 カーボンへの 2J 接続。 NMR と質量データにより、エトキシ基が親基から離れ、1,4 二置換環上にフェノール性 OH を形成したことが確認されました。 DP-5 の構造は解明されており、NMR スペクトルが図 1 と 2 に示されています。 7とS7。化学シフトを表 3 に示し、提案された分解メカニズムを図 5 に示しました。FT-IR 分析により、3443 cm-1 の伸縮周波数での OH 基の存在も確認されました。 755 cm-1 の伸縮周波数は、C-Cl 基の存在を指示します。 1750 ～ 1600 cm-1 の領域にシグナルがないことは、構造中にケト基が存在しないことを確認します。中心周波数により、アルコール、塩化物官能基の存在が確認されました。データを表 4 にまとめます。DP-5 の場合、HRMS/MS スペクトルおよびプロトン化フラグメンテーションイオンの提案された暫定メカニズムを図 1 および 2 に示します。 4とS1。

ストレス条件下でのエルツグリフロジンの分解研究は、ICH ガイドラインに従って検査されました。 API は、酸化、酸性、アルカリ性、中性、光分解、および熱分解条件にさらされました。この薬剤は塩基性、中性、熱、光分解条件において安定であり、分解生成物は観察されませんでした。ただし、酸および酸化ストレス加水分解条件では 5 つの分解生成物が形成されました。これらの分解物は、酸加水分解に不安定な環の再配置によって発生します (DP-1、DP-2、DP-3、および DP-4)。DP-5 は、次の条件下でエチル基を除去することによって形成されます。過酸化状態。すべての分解生成物は、NMR (1D および 2D 実験) や HRMS/MS 実験などのさまざまな分析技術を使用して完全に分離および特性評価されました。 FT-IR データにより、構造を確認するための追加機能が提供されました。 5 つの DP はすべて新規製品であり、どの文献にも報告されていません。現在の研究は、HRMS、FTIR、および 2D-NMR 研究を使用して、エルツグリフロジンと 5 つの分解生成物すべての完全な構造解釈を提供します。また、すべての分解生成物を良好な分解能で分離するための、よく開発された UHPLC-MS メソッドについても報告します。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

エルトゥグリフロジン

医薬品有効成分

国際調和評議会

ナトリウムグルコース共輸送体2

超高速液体クロマトグラフィー質量分析装置

フーリエ変換赤外分光法

高分解能質量分析

二次元核磁気共鳴分光法

単一四重極検出器

フォトダイオードアレイ検出器

エレクトロスプレーイオン化

勾配二量子フィルター相関分光法

勾配異種核単一量子コヒーレンス分光法

勾配ヘテロ核多重結合コヒーレンス分光法

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スレーシュ・サラコルス & ガナパバラプ・ヴィーラ・ラガヴァ・シャルマ

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ナレシュ・クマール・カタリ

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ナレシュ・クマール・カタリ & スリーカンタ・バブ・ジョンナラガッダ

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SS は、精製と HRMS 分析を含む、この研究論文のすべての実験分析を実行しました。 NKKは作品の設計に参加し、統計解析の実行、原稿の起草、監修を行いました。GVRSは理論解析に貢献し、理論的試験結果と実験的試験結果の比較を支援しました。 MK は文献の収集と作業の実行を支援しました。 UP は分解生成物の解釈に参加しています。分解生成物の NMR 分析には MR がサポートされました。 SB Jonnalagadda が原稿をレビューし、編集しました。私たちは、いかなる矛盾も生じずに記事を公開することを承認します。

ナレシュ・クマール・カタリまたはガナパヴァラプ・ヴィーラ・ラガヴァ・シャルマへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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サラコルス、S.、カタリ、NK、シャルマ、GVR 他。高度な分析技術を使用したエルツグリフロジンの新規強制分解生成物の同定、単離、および構造特性評価。 Sci Rep 13、9472 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36289-9

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公開日: 2023 年 6 月 10 日

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