個別化されたメルケル細胞癌研究のモデリングにおける免疫強化オルガノイドの応用

Scientific Reports volume 12、記事番号: 13865 (2022) この記事を引用

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メルケル細胞癌 (MCC) は稀な神経内分泌皮膚癌で、発生率は 1/100,000 未満、生存率は低く、化学療法または免疫療法に対する反応はさまざまです。 今回我々は、この稀な悪性腫瘍における個別化研究のモデリングにおける患者腫瘍オルガノイド（PTO）の応用を探ります。 未選別および非増殖のMCC腫瘍細胞を手術標本から単離し、患者に適合する血液およびリンパ節組織とともにECMベースのヒドロゲルに懸濁して、免疫増強オルガノイド（iPTO）を生成しました。 オルガノイドは化学療法剤または免疫療法剤で治療され、有効性は治療後の生存率によって決定されました。 2018年12月から2022年1月までに患者7名から9検体が募集された。確立率はPTOで88.8%（8/9）、iPTOで77.8%（7/9）であった。 一致する患者組織および PTO の組織学により、MCC マーカーの発現が実証されました。 化学療法の反応は、最も効果的な薬剤としてシスプラチンとドキソルビシンを使用した 4/6 (66.6%) の検体 (6/6 PTO セット) で示されましたが、免疫療法は試験された iPTO セットでは効果がありませんでした。 2人の患者から採取した4つの検体はペムブロリズマブに対する耐性を示し、対応する患者の治療反応と相関していた。 MCC PTO の日常的な確立と免疫強化は、切除された外科標本から直接実行可能であり、前臨床環境での個別化された研究と治療計画の探索が可能になります。

メルケル細胞癌 (MCC) は、まれで悪性度の高い神経内分泌皮膚癌で、年間発生率は 1,000,000 人あたり 0.7 人と推定されており、生存転帰は黒色腫よりも悪いです。 初期の研究では、MCC が神経堤起源から生じることが示唆されていましたが、より最近の証拠は表皮前駆細胞であることを示しています 2,3。 MCCがんの約60～80％では、悪性転換がメルケル細胞ポリオーマウイルス（MCPyV）感染の続発症として起こりますが、一部の患者では紫外線曝露に関連しており4、この2つの事象が相乗的に変異負荷と新抗原性を増加させます。 MCC腫瘍の。

MCC 患者のほとんどは局所領域疾患を患っており、選択された患者には外科的切除とその後の補助放射線療法が必要です4。 転移性疾患患者の場合、選択肢は限られていますが、MCC の希少性により、新しい薬剤との比較研究に患者を集めることが困難です 5,6。 チェックポイント阻害剤や MCPyV ワクチンの開発に対する関心が急速に高まっています 7、8、9。 しかし、2017 年に FDA の承認をもたらした免疫療法による有望な結果にもかかわらず、他の多くのがんと同様に、免疫療法に関連する毒性とともに獲得した腫瘍耐性が依然として深刻な問題となっています10。 したがって、延命効果が期待できない場合に治療に関連した副作用を回避するには、潜在的な治療失敗を予測することが重要です。

MCCの発生率は低いため、前臨床治療の有効性を判断するには臨床試験に代わる選択肢が必要です。 我々はこれまでに、中皮腫、肺、虫垂、黒色腫、肉腫、結腸直腸原発腫瘍など、いくつかの腫瘍タイプのオルガノイドモデリングの成功を報告しました。 重要なのは、これらの研究の一部は、過去数十年にわたって臨床管理においてほとんど進歩が見られなかった希少な腫瘍サブタイプを分析したことです。 これらのオルガノイドは、コラーゲンとヒアルロン酸で構成される高度に制御されたヒドロゲル系で作成することに成功し、培養のための異種基底膜抽出物の必要性がなくなりました。 PTO は製造後 1 週間以内に前臨床試験の準備が整い、臨床上の決定をサポートおよび情報提供する可能性がある期間内に治療データを提供しました。 これらの研究は、承認された治療法と治験中の治療法の両方に対する精密医療応用における有用性を実証することができました 12、15、17、18。

ここでは、個々の患者のレベルで MCC のための個別化された臨床研究プラットフォームを作成するための PTO の開発におけるこれらのアプローチの実現可能性を示します。 我々は、切除された患者組織からのMCC PTOのバイオファブリケーションを実証し、腫瘍の組織マーカーの類似性を示します。 私たちは、治験中の化学療法レジメンと承認された免疫療法治療の両方の使用を分析し、有効性を比較しました。 最後に、同じ患者からの時間的に異なる切除の結果と臨床転帰を比較することができました。 私たちは、提示されたデータは、MCC 研究における PTO の有用性を示しており、将来的には稀な悪性腫瘍の前臨床コンパニオン ツールとしての可能性を示していると考えています。

2018年12月から2022年1月までの研究期間中に、7人の患者から9個の腫瘍標本が取得されました（表1）。 腫瘍のうち 8 つは、治療スクリーニング用のオルガノイドを産生するのに十分な細胞を提供しました。 1人の患者は免疫療法を受けている間に再発疾患のため2回目と3回目の手術を受け、追加の両方の標本がオルガノイドに加工された。 さらに、7つの組織から、並行免疫療法検査用に十分な腫瘍細胞とリンパ球の別々の検体が提供され、6セットは患者の血液を使用し、1セットは切除リンパ節を使用しました（図1）。 バイオファブリケーション後、PTO は 7 日間培養され、3 日間の薬物検査を受けました。 全体として、すべての検体の薬物スクリーニング結果は 10 日以内に得られ、細胞増殖の必要がなく、臨床的に適切なタイムライン内で患者固有のデータが生成されました。

メルケル細胞癌オルガノイド作製のフローチャート。 腫瘍細胞は消化された腫瘍組織から単離されて PTO に加工され、免疫細胞は患者の血液またはリンパ組織から単離され、腫瘍細胞と結合して iPTO が作製されました。 これらのオルガノイドは 1 週間培養され、その後特徴付けられ、治療効果についてスクリーニングされました。 BioRender.com で作成されました。

オルガノイド培養における原発腫瘍細胞の維持は、正確な組織表現と治療介入に対する適切な反応にとって不可欠です。 切除組織と PTO の比較染色により、染色を特定するための高レベルの一致が実証されました (図 2 および補足図 S1)。 同様の細胞形態は、対応する患者組織とPTOで示されますが、iPTOでは免疫細胞集団が示されました（図2a、b、i、ii）。 Pan-Cytokeratin と CK20 の陽性発現は、黒色腫やその他の転移性神経内分泌腫瘍など、他の腫瘍起源の MCC を区別するために一般的に使用されます (図 2a、b、iii、iv)19。 MCC は、その由来と考えられるメルケル細胞感覚ニューロン系統に由来してその名前が付けられており、シナプトフィジン、ニューロフィラメント、クロモグラニン 20 などの神経マーカーの陽性発現も示しています。 これらのマーカーは、一致する PTO と組織の間に高い相関関係があることも示されています（図 2a、b、v–vii）。 さらに、メルケル細胞ポリオーマウイルス (MCPyV) は、患者の症例の 80% もの多くにウイルスが存在しており、病気の発症に重要な役割を果たしていると仮説が立てられています。 患者の腫瘍 7 例中 5 例 (71%) で陽性発現が観察されました (図 2a、b、viii)。 PTOおよび組織のIHC染色では、CD45およびS100の発現の欠如が示され、それぞれリンパ腫および黒色腫を含むMCCを形態学的にシミュレートする代替診断が排除されました（補足図S2）。

一致する患者組織 (Bx) およびメルケル細胞癌 PTO セットの免疫組織化学 (a) MCC5 および (b) MCC7。 組織と PTO を比較すると、(i) 細胞形態 (H&E)、(ii) iPTO 細胞形態 (H&E)、(iii) パンサイトケラチン (Pan CK)、(iv) サイトケラチン 20 (CK20)、 (v) ニューロフィラメント (NFH)、(vi) クロモグラニン A (ChgA)、(vii) シナプトフィジン (SYP、および (viii) メルケル細胞ポリオーマウイルス (MCPyV)。さらに、セット MCC5 (a) および MCC7 (b) は、 MCPyV を含む、疾患の同定と潜在的な結果に関連するマーカーすべての画像は、スケール バー 20 μM で倍率 40 倍で撮影されました。

治療スクリーニングにおける PTO の実現可能性を確認するために、現在臨床現場で使用されている一連の化学療法で PTO を治療しました (図 3、4)。 全体として、治療反応は PTO と治療の間で異なり、最も効果的なレジメンはシスプラチンとドキソルビシンの併用でした (4/6、66%)。 併用療法の分析は、患者ごとに各療法の有効成分を決定したり、新しい治療プロトコルを設計したりするのに役立つ可能性があります。 例えば、PTOセットMCC2は、シスプラチンとドキソルビシンの組み合わせに対して有意な反応を示しましたが、個々の反応をさらに分析すると、その反応は相乗的ではなく、主にドキソルビシンの細胞毒性によるものであることが示されました（図3、4ai〜iii）。 対照的に、PTOセットMCC5は同じ組み合わせを使用しましたが、個々の反応はシスプラチンがレジメンの有効性の原因であることを示唆しています（図3、4i〜iii）。

PTO の化学療法スクリーニングは、腫瘍治療反応における腫瘍間不均一性を実証します。 パーセンテージは、患者に一致する対照オルガノイドと比較した生存率です。 表中の治療用量は次のとおりです: シスプラチン (10 μM)、ドキソルビシン (1 μM)、ビンクリスチン (1 μM)、エトポシド (1 μM)、シスプラチン/ドキソルビシン (10 μM/1 μM)、シスプラチン/エトポシド (10 μM) /1μM）、ビンクリスチン/ドキソルビシン（1μM/1μM）。 緑色のボックスは生存率が 50% 未満低下し、p > 0.05 となる治療を表します。黄色のボックスは 50% を超える、または p < 0.05 を示し、赤色のボックスは生存率が 50% を超える低下、p < 0.05 を示す治療を表します。 一番下の行は、治療が有効である PTO セットの数です (生存率 < 50%、p < 0.05)。 一番右の列は、それぞれの患者オルガノイドセットにおける有効な治療の数を表します。

(i) シスプラチンを使用した、(a) MCC2 および (b) MCC5 に対する個別化された化学療法治療プラットフォームの適用。 (ii) ドキソルビシン。 (iii) ビンクリスチン。 (iv) エトポシド。 (v) シスプラチン/ドキソルビシン。 (vi) シスプラチン/エトポシドおよび (vii) ビンクリスチン/ドキソルビシン。 CellTiter-Glo 3D アッセイ結果の概要 (a) MCC2 は、(i) シスプラチン (ii) ドキソルビシン (iii) シスプラチン/ドキソルビシン、および (vii) ビンクリスチン/ドキソルビシンに対する用量依存的な治療反応を示し、(b) MCC5 はこれらの結果を示しました。 (i) シスプラチンおよび (iii) シスプラチン/ドキソルビシン。 各用量の下で、複製がデータポイントとしてリストされます。 *p < 0.05。

免疫療法の有効性の背後にあるメカニズムを効果的に研究するために、全血または正常なリンパ節組織から単離した免疫細胞を PTO 培養物に組み込み、免疫増強患者腫瘍オルガノイド (iPTO) を形成しました。 7 日間培養した後、MCC に対して承認されている 3 つの治療法、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、ニボルマブを使用して免疫療法治療を実施しました。 iPTO 治療有効性の基準である対照と比較した iPTO 生存率が 50% 未満であり、対応する iPTO 対照および治療に対応する PTO に対して統計的有意性があることから、ATP 生存率アッセイおよび共焦点顕微鏡検査では、以下のいずれの免疫オルガノイドに対する有意な免疫療法効果も確認されませんでした。 7 つの iPTO セットがテストされ、治療後の生存率の範囲は、ペムブロリズマブ、イピリムマブ (63 ～ 108%)、およびニボルマブ (74 ～ 120%) でした (図 5)。 処理されたオルガノイドの IHC 分析では、腫瘍細胞におけるグランザイム B およびカスパーゼ 3 活性によって測定される最小限の免疫介在性細胞毒性が示された一方、対照と比較した場合、研究期間を通じて CD8 + T 細胞の存在が示されました（図 6a）、補足図。 S3、S4、S5)。 MCC7およびMCC9の治療後の複数の時点で細胞ストレスおよび組織損傷のマーカーであるLDHレベルを測定すると、MCC9では24時間および48時間でLDHレベルが低下し、治療初期の治療に対するiPTO抵抗性が示唆されました（図6bi、ii） ）。

免疫療法検査アプリケーションにおける iPTO の実証。 (a) iPTO セットを免疫療法で処理し、CellTiter-Glo 3D で生存率を記録しました。 対照と比較して生存率が 50% 未満の有意な反応を示した iPTO はなく、iPTO 対照および試験した免疫療法に対する PTO 対抗治療と比較して統計的有意性は p < 0.05 でした。 (b) MCC8 の LIVE/DEAD パネル。 スケール バーは 250 ミクロンを表します。 *p < 0.05。

同じ患者において時間的に分離された腫瘍の比較分析。 (a) iPTO の免疫組織化学は、強力な CD8+ T 細胞集団を示していますが、グランザイム B を介した CK20+ 細胞の死滅は低いことを示しています。 (b) LDH 細胞ストレス分析により、ペムブロリズマブ MCC7 iPTO セットの増加が確認されましたが、MCC9 では確認されず、この患者における 2 つの腫瘍間の耐性の獲得が示唆されました。 すべての画像はスケールバー 20 μM で 40 倍の倍率で撮影されました。 *p < 0.05。

PTO を前臨床モデルに組み込むには、臨床相関が必要です。 ペムブロリズマブによる治療過程中の異なる時点で、2 人の患者から合計 4 つの外科標本を縦方向に採取しました (表 1)。 最初の患者 (MCC3) は当初、顔面に原発巣を有しており、PET/CT イメージングでは縦隔と骨盤にさらに懸念される転移性腫瘍活動性領域が認められました。 この患者は顔面の原発性MCCの切除を受け、ペムブロリズマブの補助投与を開始し、4回の点滴を受けてから回復し、対応するiPTOは56％の治療後生存率を示した（図3）。

2 番目の患者 (iPTO セット MCC2、MCC7、MCC9) は、最初の MCC 四肢切除から 10 年後に顔面再発 (MCC2) を発症しました。 PET/CT により、顔と首の複数の部位に新たな転移領域が確認されました。 7サイクルのアジュバントペムブロリズマブでは、治療に対する臨床反応がまちまちでした。 より具体的には、患者が治療を継続している間、局所制御のために切除された新たな輸送中の顔面病変を伴う疾患の進行が見られる一方で、首の転移病変で反応が観察された（MCC7）。 ペムブロリズマブ点滴をさらに 2 サイクル行っても、急速に増殖する新たな顔面腫瘍 (MCC9) の発生は妨げられず、これも切除されました。 PTO 化学療法治療を比較すると、ほとんどの単剤治療と併用療法に対する耐性の増加が実証されました (図 3)。 MCC2 iPTO は、ペムブロリズマブに対する患者の感受性を示さなかった (治療後の生存率 86%)。 再発病変（MCC7）は、ペムブロリズマブ治療後24、48、および72時間で、ペムブロリズマブ後の57％の生存率とLDHの増加を示しました（図5a、6bi）。 最後に、ＭＣＣ９は、１１９％の治療後生存率、ＬＤＨレベルの低下、およびグランザイムＢおよびカスパーゼ３活性の欠如により、ペムブロリズマブに対する感受性を示さなかった（図３、５ａ、６ｂｉｉ）。 iPTO セット MCC2 を後のセット MCC7 および MCC9 と比較すると、処理された PTO CK20+ 腫瘍細胞におけるグランザイム B およびカスパーゼ 3 の発現が減少しました（補足図 S5）。

MCC研究の進歩は、組織モデルの欠如と疾患の希少性によって長い間妨げられてきました。 ここでは、細胞増殖を行わずに切除された外科標本から PTO を作成することにより、生成から 1 週間以内の運用可能性と迅速な検査を可能にする方法について説明します。 複数の化学療法と免疫療法のレジメンが細胞毒性の有効性について比較され、個々の患者に合わせた治療法を選択する可能性と、前臨床試験での治療スクリーニングの拡張性の両方が実証されました。 さらに、2 人の患者に由来する 4 つの MCC 検体の免疫療法に対する臨床反応は、対応する iPTO によって示された反応と一致しました。 これらの PTO を最適化することで、この希少がんに対する理解が深まり、全身治療の選択が改善される可能性があります。

PTO が最初に開発されて以来、PTO は新しい治療法の研究モデルとしての能力に加えて、患者の治療法選択の比較モデルとしても機能する可能性があると理論化されてきました。 実際、複数の研究により、さまざまな種類の腫瘍による PTO の高い陽性および陰性的中率が実証されています 21、22、23、24。 PTO と臨床反応を相関させるアッセイはさまざまですが、PTO の生存率または増殖の大幅な減少が細胞毒性の有効性と相関の閾値として日常的に使用されています。 有効性を判定するために生存率の 50% 低下という厳格な閾値を利用することにより、我々は黒色腫と虫垂癌に関する以前の研究で正と負の両方の PTO 相関を示しました 15,18。 この研究では、共焦点顕微鏡法とLDH含有量による生存率も評価しましたが、これらはスループットが低いため、サポートアッセイとしてのみ使用されました。 iPTO と臨床反応との相関は、PD-1 阻害剤であるペムブロリズマブのアジュバントで以前に治療された 4 つの検体で観察されました。 反応しない切除標本から開発した iPTO セットでは、低レベルのグランザイム B を伴う CD8+ 細胞の存在、処理後の細胞生存率が 50% 以上、LDH レベルの低下が実証され、チェックポイント阻害剤の存在にもかかわらず iPTO 内の細胞傷害活性が低いことが示唆されました。 ここで提示されたオルガノイドの結果は、対応する患者が免疫療法に失敗し、局所制御を得るためにのみ手術が行われたため、免疫療法反応の欠如に人為的に偏っています。 したがって、これらの結果は、免疫療法がメルケル細胞腫瘍に効果がないことを示唆するために使用することはできません。 多施設共同の第 2 相試験では、ペムブロリズマブで治療された患者の奏効率が 56% (14/25) でした 25。 免疫療法で進行している切除病変におけるこれらの組織学的マーカーの発現の減少とともに臨床的に観察された免疫療法に対する混合反応は、治療に対して異なる反応を示す共存する悪性クローンによるクローン進化の兆候です。 これは、PTOによって示される反応は、オルガノイドの発生に使用された生検病変のみを反映しており、空間的に異なる腫瘍に腫瘍クローン性が存在する場合には必ずしも患者の全体的な反応を代表するものではないことを明確に示しています。

MCCに対する免疫療法は2017年に初めて承認され、それ以来いくつかの薬剤が開発され、患者の生存率を改善することが示されています25、26、27。 免疫機能の低下は MCC 罹患率の増加と関連しているため 28、腫瘍細胞の免疫認識の改善は治療を受けた患者に大きな利益をもたらす可能性があります 29。 メルケル細胞ポリオーマウイルスは患者の約 80% で確認されており、影響を受けた細胞で発癌促進性および抗アポトーシス性の両方のシグナル伝達を生成します 30,31。 切除された腫瘍と一致する PTO の両方で MCPyV の信頼できる一致した発現を示すことにより、提示されたオルガノイド プラットフォームは、患者に一致する抗原提示細胞が共培養された腫瘍に組み込まれる場合の抗ウイルス ベクターまたは MCC ワクチン開発の研究および開発に有用であることが証明される可能性があります。条件7、18。

ここで報告された 89% という PTO 確立率は、結腸や乳房などのより一般的ながんを使用した他の大規模研究と一致しています 21,32 (表 1)。 私たちの研究では、制御された架橋が可能な高度に特性化されたヒドロゲルを利用し、異種因子を必要とせずに一次組織細胞をサポートできる一貫した再現可能な結果を​​提供します。 PTO とのさらなる研究により、対象の組織に適合する高度にカスタマイズされた組成を備えたヒドロゲルの作成と展開が可能になる可能性があります。 化学感受性と免疫感受性の結果を生成するために説明されているオルガノイドバイオファブリケーションの 10 日間にわたるワークフローは、患者の臨床ニーズとシームレスに統合できるトランスレーショナルリサーチツールを提供し、検証後はコホート分析から臨床医が治療決定を行う方法の状況を潜在的に変える可能性があります。個人的な決定。 これは、臨床試験のデータが不足している希少腫瘍にとって特に重要です。 最後に、PTO により、いくつかの化学療法の組み合わせの相乗効果を評価することができました (図 3)。 相乗効果が観察されない場合に、併用療法で最も効果的な薬剤を選択できれば、患者は不必要な毒性を免れる可能性があります。 上記の研究は、組織を従来の「死んだ」組織腫瘍バンクから生きた組織バイオリポジトリに転用することの重要性を示しています。

MCC 用の新しい PTO モデルを作成してテストすることはできましたが、研究にはいくつかの制限が残っています。 研究のささやかな威力は、MCC の希少性の直接的な影響です。 多くの患者は免疫療法を含む全身治療を受けることが禁忌であったため、すべての検体で臨床相関を示すことはできませんでした5。 多くの切除標本は臨床的に全身治療に抵抗性の腫瘍に由来するため、提示された臨床相関は陰性的中率を示しています。 しかし、患者の生存は最終的には応答しないクローンによって決定されることは論理的であるため、無効な治療法や、関連する治療関連の毒性と費用を回避するには、非応答性クローンの特定が重要です。 陽性的中率を確立することは、今後の研究において必要なエンドポイントとなるでしょう。 最後に、放射線は MCC の潜在的な治療選択肢ですが、他の一次試験で前述したように、この治療パラメーターは私たちの研究には組み込まれませんでした 33。

MCCやその他の希少がん研究におけるPTOの期待にもかかわらず、オルガノイドは、患者の転帰と十分に裏付けられた相関データがなければ、臨床現場で応用する準備がまだ整っていません。 前向きランダム化臨床試験における相関ツールとしてオルガノイドを導入することは、広範なゲノムおよびプロテオミクスの特性評価とともに前進する方法です。 MCC PTO の日常的な確立と免疫強化は、切除された外科標本から直接実行可能であり、前臨床環境での個別化された研究と治療計画の探索が可能になります。

すべての方法は、Wake Forest Baptist Health ポリシーに従った施設のガイドラインに基づいて実行されました。

組織、血液、リンパ節の標本は、2018年12月から2022年1月の間に切除を受けた、インフォームドコンセントのある成人MCC患者から採取されました。標本は、ウェイクフォレスト人間研究保護プログラムによって承認されたIRBプロトコルに基づいて採取されました。 標本はロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地に置かれ、術後2時間の枠内で処理するためにウェイクフォレストオルガノイド研究センター（WFORCE）に移されました。

組織を受け取ったら、腫瘍を、100 U/mL ペニシリン - ストレプトマイシン、5 mg/mL ゲンタマイシン、および 5 mg/mL アンホテリシン B を含むリン酸緩衝生理食塩水で 5 分間のサイクルを 2 回洗浄しました。 可能であれば、各標本の一部が切除され、組織学に利用されました。 これは、組織がオルガノイドの研究を準備するのに十分な大きさである場合に実行されました。 標本を細かく刻み、100,000 CDA 単位/mL コラゲナーゼ HA (001-1050; VitaCyte、インディアナ州インディアナポリス)、22,000 単位/mL プロテアーゼ (003) を含むダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) の 3 mL 溶液に入れ、15 mL の円錐形に置きました。 -1000; VitaCyte)、組織 1 グラムあたり 200 U/mL DNAse 1 (07470; STEMCELL、Cambridge、MA) を 37 °C で撹拌しながら最大 60 分間処理しました。 組織が完全に溶解したら、FBSを含む冷培地で酵素消化を停止し、得られた腫瘍溶液を真空濾過キット（SCNY0060; Millipore Sigma、マサチューセッツ州バーリントン）で濾過し、その後遠心分離して細胞ペレットを単離しました。 上清を除去し、会社のプロトコールに従って細胞ペレットを赤血球溶解緩衝液（Abcam、ケンブリッジ、英国）で再懸濁した。 溶解緩衝液を除去し、NucleoCounter NC-200 (Chemometec、デンマーク) を使用して細胞を計数した。 Ficoll-Paque PLUS および対応するプロトコル (GE Healthcare、米国シカゴ) を使用してリンパ球を回収するために患者から全血を採取しました。 iPTO 作製のために、1 人の患者から正常なリンパ節が採取されました。 リンパ節は、上記の組織全体と同様に処理されました。

腫瘍細胞ペレットを、0.1% w/v Irgacure 2959 (5200、Advanced BioMatrix、カリフォルニア州サンディエゴ) を製造業者の指示に従って調製したチオール修飾ヒアルロナン/ヘパリン (Heprasil; Advanced Biomatrix、カリフォルニア州サンディエゴ) で再懸濁しました。光開始剤と 3 mg/mL メタクリル化コラーゲン (PhotoCol; Advanced Biomatrix) 溶液を体積比 1:3、細胞密度 1000 万細胞/mL に調整します。 患者由来の腫瘍オルガノイド (PTO) は、5 μL のヒドロゲル/細胞混合物を 96 ウェル非組織培養プレートの個々のウェルに播種することによって作成され、紫外線 (365 nm、18 W/cm2) に曝露することによって光架橋されました。 BlueWave 75 V.2 UV スポット ランプ (Dymax Corp.、コネチカット州トリントン) から 1 秒間照射してオルガノイドを架橋します。 PTO は、5% FBS、1% ペニシリン - ストレプトマイシン、1% l-グルタミン、50 ng/mL EGF (PHG 0313; ThermoFisher Scientific)、10 µM Y-27632 (S1049, Selleckchem) を含む DMEM-F12 を含む 200 mL 培地で培養しました。 、テキサス州ヒューストン）で培地を 3 ～ 4 日ごとに交換します。

免疫増強 PTO (iPTO) は、適合する患者の全血 (血液 iPTO) またはリンパ節組織 (リンパ iPTO) からの免疫担当細胞を細胞収量に応じて 3:1 ～ 5:1 の比率で腫瘍細胞と組み合わせて作成され、播種されました。上記のようにプレート上に置きます。 オルガノイドには、腫瘍および CD8+ 細胞に加えて、CD4+ 細胞および APC 細胞、ならびに以前に記載された間質が含まれています 15,18。 オルガノイドは、治療前に 7 日間培養されました。

続いて、7日間の培養後にオルガノイドを処理しました。 化学療法には、シスプラチン (1、10、100 μM) (232120、Sigma Aldrich)、ドキソルビシン (0.1、1、10 μM) (S1208、Selleckchem)、ビンクリスチン (0.1、1、10 μM) (V8879 Sigma Aldrich)、ドキソルビシンとシスプラチン (0.1/1、1/10、10/100 μM)、シスプラチンとエトポシド (S1125、Selleckchem) (1/0.1、10/1、100/10 μM) (Selleckchem)、およびドキソルビシンとビンクリスチン (0.1/0.1) 、1/1、10/10μM）。 免疫療法治療では、100 nM のペムブロリズマブ (A2002、Selleckchem)、イピリムマブ (A2001、Selleckchem)、またはニボルマブ (A2005、Selleckchem) を並行治療で iPTO と PTO の両方に使用しました。 培地をウェルから除去し、培地に混合された薬剤溶液を添加した。 オルガノイドは、エンドポイント生存率評価の前に 72 時間、処理培地溶液中に残されました。

薬物含有培地中で 3 日間インキュベートした後、オルガノイドを LIVE/DEAD 染色、CellTiter-Glo 3D、および LDH-GLO 細胞毒性生存率アッセイで評価しました。 LIVE/DEAD 染色 (L3224; Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド) を製造元のプロトコールに従って実行し、イメージング前に 37 °C で 2 時間インキュベートしました。 蛍光イメージングは​​、Leica TCS LSI マクロ共焦点顕微鏡 (Leica Microsystems Inc.、イリノイ州バッファローグローブ) を使用して実行されました。 赤と緑のチャンネルからの画像がオーバーレイされ、最大投影で積み重ねられました。

CellTiter-Glo 3D 細胞生存率 (G968B; Promega、ウィスコンシン州マディソン) および LDH-GLO 細胞毒性アッセイ (J2381; Promega) を利用して、定量的生存率を評価しました。 LDH (ラクトースデヒドロゲナーゼ) は、細胞のエネルギー形成において複数の必要なステップを触媒する酵素です。 LDH の放出は細胞ストレスのマーカーであり、組織損傷の測定に臨床的に利用できます。 このマーカーのわずかな増加を観察することで、これらの細胞がストレスや細胞損傷を受けていないことを確認することが可能です。これは、アッセイの減少を犠牲にして、CellTiter-Glo 3D とは対照的に細胞損傷の非溶解測定として利用できます。スループット。 CellTiter-Glo 3D 細胞生存率アッセイでは、培地の半分 (100 mL) を個々のウェルから除去し、100 mL のアッセイ試薬を各ウェルに加え、シェーカー上で室温で 30 分間インキュベートしました。 LDH-GLO細胞毒性アッセイは、処理後1、2、3日目の培地を保存し、製造業者の仕様書に従って同日にアッセイを実行することによって実施した。 両方のアッセイのウェル内容物を Costar White Polystyrene 96 ウェル アッセイ プレート (3912; Corning, NY) に移し、Veritas Microplate Luminometer (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA) で分析しました。

培養10日目に、組織学のためにオルガノイドを4%パラホルムアルデヒド中で4時間固定した。 オルガノイドを処理し、パラフィン包埋し、染色のために 5 μm 間隔で切片化しました。 オルガノイドおよび組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色しました。

PTO および組織細胞集団を同定するために、発色免疫組織化学を実施しました。 抗原賦活化は、pH 6 クエン酸緩衝液を使用して未染色のスライド上で実行されました。 組織とオルガノイドをサイトケラチン 20 (CK20、ab76126、Abcam)、汎サイトケラチン (Pan-CK、NBP2-29429、NOVUS、コロラド州センテニアル)、ニューロフィラメント (NFH、13-1300、Thermofisher、マサチューセッツ州ウォルサム)、シナプトフィジン (SYP、MA5-14532、Thermofisher)、クロモグラニン A (ChgA、ab15160、Abcam)、およびメルケル細胞ポリオーマウイルス T 抗原 (MCPyV、MABF2316、Millipore Sigma) の一次抗体を一晩処理しました。 適切なビオチン化二次抗体 (abcam) を 1 時間インキュベートした。 次いで、スライドをDAB溶液(SK-4105、Vector Laboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国)に2分間曝露し、ヘマトキシリンで対比染色した。 イメージングは​​、オリンパス BX-63 顕微鏡 (オリンパス、東京、日本) で実行されました。

iPTO 免疫療法の治療反応を特徴付けるために、蛍光免疫組織化学 (IHC) を使用して追加の染色を実行しました。 未染色のスライドは、Dako プロテイン ブロックで 30 分間ブロックする前に、pH 6 クエン酸緩衝液で抗原回復を受けました。 蛍光 IHC は、切断されたカスパーゼ 3 (9661S、Cell Signaling Technologies、マサチューセッツ州ダンバース)、CD-8 (ab4055、abcam)、CK-20 (MA5-13263、Invitrogen)、およびグランザイム B (ab4059、abcam) に対する抗体を使用して実行されました。スライドはそれぞれ 1:500、1:200、1:200、1:100、1:400 の比率で表示されます。 4℃で一晩インキュベートした後、適切な種の反応性二次Alexa Fluor 488またはAlexa Fluor 594抗体(Biotium、Fremont、CA)を1:1000希釈でサンプルに1時間適用しました。 次いで、切片をＤＡＰＩとともに５分間インキュベートした後、カバースリッピングによる最終処理を行った。 オリンパス BX-63 正立蛍光顕微鏡を使用して切片を画像化した。 蛍光イメージングのピクセル定量化は、ImageJ FIJI ソフトウェアを使用して実行されました。

オルガノイドの治療効果を表すものについてはコンセンサスがありません。 ここでは、オルガノイドが治療に応答すると考えるための保守的なアプローチを利用します。これは、iPTO が同時に満たす必要がある 3 つの異なる基準で構成されます: (1) 未処理 (コントロール) オルガノイドと比較した場合、統計的に有意な細胞生存率の低下を示す (例: iPTO 対照 vs iPTO 処理)、(2) 免疫増強条件と非免疫増強対抗条件の処理オルガノイドを比較した場合、統計的に有意な細胞生存率の低下を示します (例: 免疫療法で処理した iPTO vs 免疫療法で処理した PTO)、( 3) 免疫療法後の CellTiter-Glo 3D 生存率 < 50% を示します。

同様に、非免疫増強型 PTO は 2 つの基準を達成する必要があります：（1）未処理の PTO 対照オルガノイドと比較して統計的に有意な生存率の低下を示すこと、および（2）治療後の CellTiter-Glo 3D 生存率の > 50% 低下を示すこと。 我々は、治療反応を示唆する最低閾値として生存率の 50% 低下を任意に選択しました。 この数値は、研究する必要がある望ましい腫瘍反応、または個々の患者の動態および腫瘍生物学に基づいて変更でき、プラットフォームの可塑性を示しています。

すべてのデータは、各実験グループの平均 ± 標準偏差として表されます。 各条件の組み合わせは、分析用の 3 つ以上のオルガノイドで構成されていました。 処理されたオルガノイドの CellTiter-Glo 3D アッセイ値は、統計分析の前に条件が一致した (iPTO または PTO) コントロールに対して標準化されました。 2 つのサンプル t 検定を使用して、細胞生存率が目的の比較グループ間で異なるかどうかを評価しました。 治療グループが治療に対する反応を示したかどうかを決定するために、厳密な閾値が選択されました。 この閾値では、オルガノイドを治療反応であるとみなすために、すべての治療反応条件 (前のセクションで特定) が満たされる必要があります。 このアプローチは、タイプ 1 エラーが発生する確率を減らすために使用されました。 具体的には、上記の 2 つの t 検定が両方とも p < 0.05 で有意である確率 (両方とも治療反応の証拠が示されたためではなく) は 0.25% になります。 さらに、免疫療法後の CellTiter-Glo 3D 生存率が 50% 未満である確率がランダムな事象である場合 (つまり、偶然に発生する可能性が 50%)、3 つの事象すべてが偶然に同時に発生する合計確率は次のようになります。免疫療法研究では0.125%または10,000件中12.5件。 未処理のコントロール PTO が培養 10 日目に適切な生存能力を示した場合、薬物スクリーニング研究は患者にとって成功したと判断され、これは薬物スクリーニングの終了と同時に行われました。 適切な生存率は、ブランク値が対照条件の 1% 未満であると表されます。 統計分析は、GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.、米国) を使用して実行されました。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、疾患の希少性に基づいて患者を特定する情報のリスクがあるため一般には公開されていませんが、合理的な要求に応じて責任著者から入手可能です。

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私たちは、組織の調達とデータ管理における支援について、Libby McWilliams、Matthew Ebert、および Kathleen Perry (Atrium Health Wake Forest Baptist Medical Center) の功績に深く感謝します。 SDF は国立衛生研究所からの助成金 (T32CA247819) によって支援されています。 KIV は、NIH/NCI R01CA249087、R01CA258692、中皮腫研究財団、およびウェイク フォレスト総合がんセンターからの資金提供を認めています。

ウェイク フォレスト再生医学研究所、ウェイク フォレスト医科大学、ウィンストン セーラム、ノースカロライナ州、米国

スティーブン・D・フォーサイス、プレストン・レイニー、ヘマミラマル・シヴァクマール、アレクサンダー・スカルダル、シェイ・ソーカー、コンスタンティノス・I・ボタノプロス

米国ノースカロライナ州ウィンストンセーラムのウェイクフォレスト医科大学癌生物学部

スティーヴン・D・フォーサイス、アレクサンダー・スカルダル、シェイ・ソーカー、コンスタンティノス・I・ボタノプロス

ウェイク フォレスト オルガノイド研究センター (WFORCE)、ウィンストン セイラム、米国

スティーヴン・D・フォーサイス、リチャード・A・エラリ、プレストン・レイニー、シェイ・ソーカー、コンスタンティノス・I・ボタノプロス

外科、外科腫瘍科、ウェイク フォレスト バプティスト ヘルス、ウェイク フォレスト大学、メディカル センター ブールバード、ウィンストン セイラム、ノースカロライナ州、27157、米国

リチャード・A・エラリ & コンスタンティノス・I・ボタノプロス

ウェイク フォレスト総合がんセンター、ウェイク フォレスト医科大学、ウィンストン セーラム、米国

リチャード・A・エラリ、シェイ・ソーカー、コンスタンティノス・I・ボタノプロス

オハイオ州立大学、生体医工学部、米国オハイオ州コロンバス

血乳管シヴァクマール & アレクサンダー・スカルダル

米国ノースカロライナ州ウィンストンセーラムのウェイクフォレスト医学部病理学教室

李文成

オハイオ州立大学およびアーサー G. ジェームス総合がんセンター（米国オハイオ州コロンバス）

アレクサンダー・スカルダル

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SDF と RAE は実験を計画・実施し、原稿の執筆にも貢献しました。 HSとPLが実験を行いました。 WL は画像の分析を提供し、執筆に貢献しました。 AS と SS は実験を計画し、執筆に貢献しました。 KIV は標本を提供し、実験を計画し、原稿の執筆に貢献しました。

コンスタンティノス I. ボタノプロスへの往復書簡。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

フォーサイス、SD、エラリ、RA、レイニー、P. 他個別化されたメルケル細胞癌研究のモデリングにおける免疫強化オルガノイドの応用。 Sci Rep 12、13865 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-17921-6

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受信日: 2022 年 3 月 8 日

受理日: 2022 年 8 月 2 日

公開日: 2022 年 8 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17921-6

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